Isolamento dei mastociti peritoneo-derivati e loro caratterizzazione funzionale con Ca2 +-imaging e degranulazione saggi
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per isolare e coltivare mastociti peritoneali murini. Inoltre descriviamo due protocolli per la loro caratterizzazione funzionale: un imaging fluorescente della concentrazione intracellulare di gratuito Ca2 + e un test di degranulazione basata sulla quantificazione colorimetrica della β-esosaminidasi rilasciato.
Abstract
Mastociti (MCs), come parte del sistema immunitario, gioca un ruolo chiave nella difesa ospite contro parecchi agenti patogeni e nell’inizio della risposta immunitaria allergica. L’attivazione di MCs via il cross-linking di superficie IgE associato al recettore ad alta affinità IgE (FcεRI), così come attraverso la stimolazione di parecchi altri ricevitori, avvia l’aumento del libero intracellulare Ca2 + livello ([Ca2 +]i) che promuove il rilascio di mediatori infiammatori e allergici. L’identificazione dei costituenti molecolari coinvolti in queste vie di segnalazione è fondamentale per la comprensione del regolamento della funzione di MC. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l’isolamento di tipo murino tessuto connettivo MCs di lavaggio peritoneale e coltivazione di MCs peritoneale (PMC). Culture di MCs da vari modelli di mouse di knockout di questa metodologia rappresentano un approccio utile per l’identificazione delle proteine coinvolte nella MC vie di segnalazione. Inoltre, abbiamo anche descrivere un protocollo per singola cella Fura-2 di imaging, come un’importante tecnica per la quantificazione di Ca2 + segnalazione al MCs. fluorescenza-basata monitoraggio [Ca2 +]i è un affidabile e comunemente usato approccio alla Studio Ca2 + segnalazione eventi, inclusa l’entrata di calcio store-operati, che è della massima importanza per l’attivazione di MC. Per l’analisi di MC degranulazione, descriviamo un’analisi del rilascio β-esosaminidasi. La quantità di β-esosaminidasi rilasciato nel terreno di coltura è considerata come un indicatore di degranulazione per tutti i tre diversi sottoinsiemi secretivi descritto in MCs. β-esosaminidasi può essere facilmente quantificato dalla sua reazione con un substrato di colorigenic in un analisi colorimetrica del piastra microtiter. Questa tecnica altamente riproducibile è conveniente e non richiede nessuna apparecchiatura specializzata. Nel complesso, il protocollo fornito di seguito viene illustrato un alto rendimento di MCs che esprimono marcatori di superficie tipici di MC, visualizzazione di caratteristiche morfologiche e fenotipiche tipiche di MCs e dimostrando le risposte altamente riproducibili per secretagoghi in Ca2 +– analisi di imaging e degranulazione.
Introduction
MCs gioca un ruolo di primo piano durante la risposta immunitaria innata ed acquisita. In particolare, MCs partecipare l’uccisione degli agenti patogeni, quali batteri e parassiti e anche degradare peptidi endogeni potenzialmente tossici o componenti dei veleni (per vedere la recensione Galli et al. 20081). Il ruolo fisiologico di MCs nell’immunità innata e adattiva è oggetto di acceso dibattito. Pertanto, le numerose discrepanze di dati negli studi effettuati con diversi modelli di mouse MC-carenti richiedono una rivalutazione sistematica delle funzioni immunologiche di MCs oltre allergia2. MCs maturo sono principalmente localizzati in tessuti e organi come la pelle, del polmone e intestino e solitamente sono trovati soltanto in piccole quantità nel sangue. MCs derivano da precursori ematopoietici, come progenitori MC e completare la loro differenziazione e maturazione nei microambienti di quasi tutti i tessuti vascolarizzati1. T-cellula-derivati fattore interleuchina (IL) -3 promuove selettivamente la vitalità, la proliferazione e la differenziazione di una popolazione pluripotenti del mouse MCs da loro progenitori ematopoietici3. Fattore della cellula formativa (SCF) è prodotto dalle cellule strutturali nei tessuti e svolge un ruolo cruciale nello sviluppo, sopravvivenza, migrazione e funzione4MC. Le proprietà di singoli MCs possono differire a seconda della loro capacità di sintetizzare e memorizzare varie proteasi o proteoglicani. Nei topi, il cosiddetto tessuto connettivo-tipo MCs si distinguono dalle mucose MCs secondo la loro localizzazione anatomica, la morfologia e il contenuto di eparina e proteasi5.
Nel MCs, un aumento di libero citosolico Ca2 + ([Ca2 +]i) è indispensabile per la produzione degli eicosanoidi e degranulazione, così come per la sintesi di citochine e l’attivazione di fattori trascrizionali in risposta all’antigene e diversi secretagoghi6. Un importante obiettivo a valle di questi stimoli è fosfolipasi C, che idrolizza il fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato diacilglicerolo (DAG) e inositolo 1,4,5-trifosfato. DAG attiva la proteina chinasi C e IP3 rilascia ioni di Ca2 + dal reticolo endoplasmatico. Lo svuotamento di questi negozi attiva afflusso di Ca2 + attraverso la membrana plasmatica Ca2 + canali, portando a memorizzare voce calcio gestito (SOCE). Questo processo è evocato attraverso l’interazione del Ca2 +-sensore, stromal interazione molecola-1 (Stim1), nel reticolo endoplasmatico con Orai17 , nonché attraverso l’attivazione di recettori transitoria potenziali canonico (TRPC) canale proteine (per review Vedi Freichel et al. 20148) nella membrana plasmatica.
Per studiare il ruolo fisiologico di questi canali, molti farmacologici (applicazione di bloccanti dei canali) o approcci genetici sono tipicamente utilizzati. In quest’ultimo caso, soppressione dell’espressione della proteina è realizzata prendendo di mira il mRNA (atterramento) o la modifica di DNA genomico con globale o tessuto-specifici9 omissione di un esone codifica un poro che formano unità secondaria di un canale (knockout). La disponibilità di un bloccante con sufficiente specificità per questi canali è limitata. Inoltre, l’approccio atterramento richiede controllo attento della sua efficacia utilizzando, ad es., Western blot analisi ed è ostacolata dalla mancanza di anticorpi specifici per la proteina canale mirato in molti casi. Così, l’utilizzo di modelli murini knockout è ancora considerato come il gold standard per questo tipo di analisi. Un modello preferito in vitro per lo studio delle funzioni MC è la coltivazione di PMC che può essere isolato ex vivo come una popolazione completamente matura (al contrario di differenziazione MCs in vitro da, ad es., cellule del midollo osseo)10 . Rispetto al midollo osseo derivato MCs (cellule), che vengono anche comunemente utilizzati per studiare la funzione MC in vitro, la stimolazione di FcεRI e beta-esosaminidasi rilascio è aumentato 8 volte e 100 volte in PMCs, rispettivamente. In questo articolo, descriviamo un metodo di isolamento e coltura di PMCs murino, che permette di ottenere dopo 2 settimane di coltura un numero elevato di puro tessuto connettivo tipo MCs, sufficiente per un’ulteriore analisi.
Nonostante i recenti progressi nello sviluppo e applicazione di indicatori di calcio codificato geneticamente, il loro uso è ancora limitata da difficoltà nella consegna dei geni alle cellule bersaglio, in particolare, in cellule altamente specializzate quali primaria MCs coltivate. Inoltre, questo gruppo di indicatori fluorescenti per [Ca2 +]io misure manca ancora raziometrici coloranti con un’alta gamma dinamica. Per questi motivi, il metodo preferito per raziometrica [Ca2 +]ho misura è ancora l’uso del colorante fluorescente “Fura-2”11.
Attualmente, il più diffuso approccio per la valutazione dell’attivazione di MC e degranulazione è la misura dell’attività β-esosaminidasi. Β-esosaminidasi, un mediatore allergico, sono uno dei componenti del granello di MC che è co-pubblicato con istamina in proporzione costante da MCs12. Β-esosaminidasi possono essere misurata facilmente e con precisione attraverso la reazione con un substrato specifico, che produce una quantità misurabile di un prodotto colorigenic che è facilmente rilevabile in un saggio colorimetrico di micropiastre. In questo articolo, un’applicazione di questa tecnica per l’analisi del degranulation di PMC in risposta a vari stimoli è segnalata.
Aggregazione del recettore IgE plasmalemmal ad alta affinità (FcɛRI) attiva nel MCs una versatile via di segnalazione intracellulare, che conduce ad un rilascio del granello secretivo contenuto nello spazio extracellulare circostante. Oltre l’antigene specifico, molti altri stimoli possono attivare MCs per rilasciare una gamma diversificata di mediatori di immunomodulatori, come complemento anafilotossine (ad es., C3a e C5a)13, il vasocostrittore del peptide endotelina 1 (ET1)14 , così come numerose sostanze cationiche e farmaci provocando reazioni pseudoallergiche (ad es., icatibant)15 legandosi a MRGPRX216. Vie di segnalazione intracellulari coinvolti nella degranulazione MCs indotta da MRGPR sono poco caratterizzate rispetto FcɛRI-mediata segnalazione intracellulare; queste vie solo cominciato a essere studiato intensivamente durante l’ultimo pochi anni17 dopo l’ identificazione del recettore16. In gran parte, i canali ionici di membrana plasmatica coinvolti nella voce calcio seguita da stimolazione MRGPRX2 rimangono per essere capito. Pertanto, il presente articolo si concentra anche su segnalazione del calcio intracellulare e degranulazione di MCs stimolate con gli agonisti MRGPR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelli di MC possono essere utilizzati con successo per lo studio MC degranulazione, chemiotassi, adesione, come pure di delucidare le vie di trasduzione del segnale intracellulare coinvolte nell’attivazione di MC. Alcuni ricercatori uso umano MCs modelli, ad esempio linee immortalizzate (LAD2 e HMC1) o MCs umano derivati dal cordone sanguigno cellule progenitrici (cellule CD133 +) e cellule progenitrici del sangue periferico (CD34 +). Altri preferiscono roditore modelli MC, come immortalati (leucemia basophilic ratto l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desidera ringraziare Julia Geminn per assistenza tecnica in preparazione delle cellule di albero e coltura. Questo lavoro è stato supportato da The transregionali Collaborative Research Centre (TR-SFB) 152.
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
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