Кролик модель прочного трансген выражения в яремной для общей сонной артерии взаиморасположение графтов
Summary
Этот метод описывает размещения разъединительных вен графтов в кроликов, трансдукции графтов и достижение прочного трансген выражения. Это позволяет расследования физиологических и патологических роли трансгенов и их белковых продуктов в привитые вен и тестирование генной терапии для трансплантата болезни вен.
Abstract
Вен трансплантата шунтирования является общей лечения артериальной облитерирующий эндартериит; Однако долгосрочный успех ограничивается отказа трансплантата вследствие тромбоза, гиперплазия интимы и атеросклероза. Цель этой статьи заключается в том, чтобы продемонстрировать метод для размещения двусторонних венозной взаиморасположение графтов в кролика, а затем преобразователя графтов с вектором передачи гена, который достигает прочный трансген выражение. Метод позволяет расследование роли биологических генов и их белковых продуктов в нормальной вен трансплантата гомеостаза. Она также позволяет тестирование трансгенов для мероприятий, которые могли бы предотвратить вен трансплантата сбоя, например., ли выражение трансген предотвращает рост neointimal, уменьшает воспаление сосудистой или уменьшает атеросклероз у кроликов кормят с высоким содержанием жиров диеты. Во время первоначального выживания хирургии сегменты правого и левого внешнего яремной подакцизным и помещены на двусторонней основе как обратный конец в бок общей сонной артерии взаиморасположение графтов. В ходе второй операции выживания, выполнено 28 дней спустя каждый графтов изолирован от обращения с сосудистой клипов и люменов (через arteriotomy) заполнены раствор, содержащий вспомогательные зависимых аденовирусных вектор (HDAd). После инкубации 20-мин атмосферный вектор решения, ремонт arteriotomy и потока восстанавливается. Вены собирают в моменты времени, продиктовано отдельных экспериментальных протоколов. 28-день задержки между размещения трансплантата и трансдукция необходима для обеспечения адаптации вен трансплантата к артериальной циркуляции. Эта адаптация избегает быстрой потере трансген выражения, которое происходит в духе графтов преобразованы до или сразу же после прививки. Метод является уникальным в его способности добиться прочного, стабильного трансген выражение в привитые вен. По сравнению с другими моделями трансплантата крупных животных вен, кролики имеют преимущества низкой стоимости и простой обработки. По сравнению с моделями трансплантата грызунов вен, кролики имеют больше и легче манипулировать кровеносных сосудов, которые обеспечивают обильное ткани для анализа.
Introduction
Атеросклероз является хроническим воспалительным заболеванием, в котором накопление липидов и воспаление в стенке сосудов ведут к сужению просвета сосуда, инфарктов, инсультов и потеря конечностей1,2. Чрескожного вмешательства (например., ангиопластика и стентирование) и медицинской терапии (например., статины и антиагрегантов агентов) являются полезным лечения атеросклероза; Однако они часто оказываются неэффективными в лечении тяжелой обструктивной болезни как коронарные и периферические тиражами. Шунтирование, использование аутогенных вен сегментов, остается общей процедуры для лечения пациентов с тяжелой, диффузные заболевания коронарных и периферических сосудов3,4. Однако, вен графтов в обоих коронарных и периферической циркуляции имеют плохой долгосрочные показатели проходимости. В коронарное кровообращение примерно 10-20% вен, которые графтов закрыта на 1 год и 50% являются закрыта 10 лет5,6. В периферической циркуляции вен трансплантата отказов являются 30-50% на 5 лет7.
Генная терапия является привлекательным подход для предотвращения отказа трансплантата вен, потому что он может доставить продукт терапевтических генов именно на месте этого заболевания. Соответственно многочисленные доклинические исследования проверили вен трансплантата генной терапии8,9. Однако по сути все эти исследования изучили эффективность раннего времени точек (2-12 недель)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. Мы осознаем, что без доказательств, что вмешательства генной терапии может обеспечить прочный (лет) защиту конце вен трансплантата, обычно является результатом neointimal гиперплазия и атеросклероза4. Мы разработали метод, который позволяет прочный трансген выражение в привитые вен и тем самым позволяет тестирование вмешательства генной терапии в конце, а также раннее время точках. Для достижения прочного трансген выражения, метод включает в себя HDAd векторов и задержки трансдукции стратегии. HDAd векторов обеспечивают длительное трансген выражение, потому что им не хватает вирусных генов, предотвращение признания (и неприятие) transduced клеток иммунной системы18,19,20, 21. отсроченная трансдукции (выполненных 28 дней после размещения трансплантата) предотвращает потерю transduced клеток во время процесса arterialization, который происходит рано после прививочных22.
Другие методы, обеспечивающие достижение терапевтического трансген выражение в стенке трансплантата вен полагаются на трансдукции вен трансплантата в то время трансплантата размещения10,11,12,15,16 ,17. При измерении серийно, выражение трансген, используя этот подход быстро снижается после трансдукции22,23. Соответственно исследования, используя этот подход не изучили эффективность за 12 недель после прививки вен, с наиболее не оценке эффективности за 4 недели. В противоположность этому, наш метод достигает вен трансплантата трансген выражение, которое сохраняется стабильно по крайней мере 24 недель и-на основе аналогичных исследований, выполненных в артерии вероятно продолжается гораздо дольше,22,24. Мы осознаем не других вен трансплантата генной терапии вмешательства, которое достигает стабильного трансген выражение этой продолжительности.
Мы использовали модель Кролик для разработки нашего метода. Другие использовали грызуны, кролики, или крупных животных для тестирования вен графт генной терапии10,11,12,,1516,17,25, 26. По сравнению с моделями грызунов, кролики являются более дорогими и распространяются более жесткие нормативные требования. Однако, по сравнению с более крупных животных (например., свиньи и собаки), кролики гораздо дешевле купить и дома и гораздо проще в обращении. Кроме того, кролик сосуды напоминают человеческие сосуды физиологически27, они являются достаточно большими, что они могут быть использованы для тестирования чрескожного вмешательства28,29, и они обеспечивают достаточно ткани, несколько конечных точек (например., гистология, белка, РНК) может проверяться с помощью одного сосуда образца22,30. Кроме того когда кролики с вен графтов кормили с высоким содержанием жиров диеты, они разрабатывают вен трансплантата атеросклероза31,32, который является распространенной причиной ишемической объездной вен трансплантата провал4,5 . Эти трансплантаты вен атеросклеротической кролик может служить в качестве субстрата для тестирования генная терапия выступления участников с помощью этого метода. Указанный протокол может помочь следователям освоить технические навыки, необходимые для достижения прочного трансген выражение в кролика вен графтов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важнейшие шаги в этом протоколе включают управление анестезии, Антисвертывающая, хирургические манипуляции Вены, артерии/привитые и гемодинамических измерения привитые Вены. Надлежащее управление анестезия имеет решающее значение в этой несколько выживания хирургии модели, которая…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
- Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
- Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
- Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
- de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
- Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
- Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
- Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
- Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
- Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
- Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
- Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
- Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
- Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
- Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
- Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
- Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
- Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
- Chen, H. -. H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
- Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 135-142 (2011).
- Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
- Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
- Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W. Atherosclerosis in rabbit vein grafts. Arteriosclerosis. 9, 374-379 (1989).
- Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
- Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
- Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
- Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
- Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
- Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
- Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
- Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
- Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
- Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
- Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).
