Un modèle de lapin d’Expression du transgène durables dans la veine jugulaire à des greffes d’Interposition artère carotide commune
Summary
Cette méthode décrit le placement des greffes de veine d’interposition chez le lapin, la transduction des greffons et la réalisation d’expression du transgène durables. Cela permet à l’enquête des rôles physiologiques et pathologiques des transgènes et leurs produits protéiques dans les veines greffées et essais de thérapies géniques pour veine du greffon.
Abstract
Pontage aorto-coronarien greffe veineuse est un traitement pour la maladie artérielle occlusive ; Cependant, les succès à long terme est limitée par échec de greffe à cause de la thrombose, l’hyperplasie intimale et l’athérosclérose. L’objectif de cet article est de démontrer une méthode pour placer greffes d’interposition veineuse bilatérale chez un lapin, puis transduction les greffons avec un vecteur de transfert de gène qui permet d’obtenir l’expression transgénique résistant. La méthode permet à l’enquête sur le rôle biologique des gènes et de leurs produits protéiques dans l’homéostasie greffe veine normale. Il permet également l’essai de transgènes pour les activités qui pourraient empêcher la défaillance d’une greffe veineuse, par exemple., si l’expression d’un transgène empêche la croissance néointimale, réduit l’inflammation vasculaire ou réduit l’athérosclérose chez les lapins nourris avec une alimentation riche en graisses. Au cours d’une chirurgie de survie initiale, les segments de droite et gauche veine jugulaire externe sont excisés et placés sur le plan bilatéral comme bout à l’autre inversé l’artère carotide commune greffes interposition. Au cours d’une deuxième chirurgie survie, 28 jours plus tard, chacun des greffons est isolé de la circulation avec clips vasculaires et les lumières sont remplis (via une artériotomie) avec une solution contenant le vecteur adénoviral (HDAd) dépendant d’assistance. Après une incubation de 20 min, la solution de vecteur est aspirée, l’artériotomie est réparé, et débit est rétabli. Les veines sont récoltés aux moments dictés par des protocoles expérimentaux. Le délai de 28 jours entre le placement de la prothèse et la transduction est nécessaire pour assurer l’adaptation de la prothèse de veine de la circulation artérielle. Cette adaptation permet d’éviter une perte rapide de transgene expression qui se produit dans la veine des greffes transduites avant ou immédiatement après la greffe. La méthode est unique dans sa capacité à atteindre l’expression TRANSGENIQUE durable et stable dans les veines greffées. Par rapport aux autres modèles de prothèse de grande veine animaux, lapins possèdent des avantages de manipulation facile et faible coût. Par rapport aux modèles de greffe de veine rongeurs, lapins ont de plus gros et plus facile-à-manipuler des vaisseaux sanguins qui fournissent des tissus abondante pour l’analyse.
Introduction
L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique dans laquelle l’accumulation de lipides et l’inflammation dans la paroi des vaisseaux sanguins conduisent au rétrécissement de la lumière du vaisseau, crises cardiaques, accidents vasculaires cérébraux et perte de membres1,2. Interventions percutanées (e.g., angioplastie et pose d’un stent) et un traitement médical (e.g., agents antiplaquettaires et de statines) est utile comme traitement pour l’athérosclérose ; Cependant, ils sont souvent inefficaces dans le traitement de maladie obstructive sévère dans les circulations coronaires et périphériques. La greffe de pontage, utilisant des segments de veine autogène, reste une procédure commune pour traiter les patients avec maladie vasculaire coronaire et périphérique sévère et diffuse3,4. Cependant, la veine greffons placés dans les deux les coronaires et des circulations périphériques ont de faibles taux de perméabilité à long terme. Dans la circulation coronaire, environ 10 à 20 % de veine greffes sont obstrués à 1 an et 50 % sont obstrués par 10 ans5,6. Dans la circulation périphérique, veine taux d’échec de greffe sont 30 à 50 % à 5 ans7.
La thérapie génique est une approche intéressante pour la prévention de l’échec de greffe veineuse car il peut fournir un produit de gène thérapeutique précisément sur le site de la maladie. En conséquence, de nombreuses études précliniques ont testé veine greffe génique thérapie8,9. Cependant, essentiellement, toutes ces études ont examiné l’efficacité au début temps points (2-12 semaines)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. nous sommes au courant d’aucune preuve que les interventions de la thérapie génique peuvent fournir durable protection (années) contre fin échec de greffe veineuse résultant généralement d’athérosclérose et l’hyperplasie néointimale4. Nous avons développé une méthode qui permet l’expression transgénique résistant dans les veines greffées et permet ainsi l’essai des interventions de la thérapie génique aux moments mais aussi fin qu’au début. Pour atteindre l’expression du transgène durables, la méthode intègre HDAd vecteurs ainsi qu’une stratégie de transduction retardée. HDAd vecteurs fournissent prolongée transgene expression parce qu’ils manquent des gènes viraux, empêchant la reconnaissance (et le rejet) des cellules transduits par le système immunitaire18,19,20, 21. Delayed transduction (effectués 28 jours après la pose de prothèse) empêche la perte de cellules transduits au cours du processus d’arterialization qui se produit tôt après le greffage,22.
Autres méthodes qui atteignent l’expression de transgènes thérapeutiques dans la paroi de la prothèse veine s’appuient sur la transduction de la greffe veineuse au moment de la greffe placement10,11,12,15,16 ,,17. Lorsqu’elle est mesurée en série, transgene expression à l’aide de cette approche diminue rapidement après la transduction22,23. Par conséquent, en utilisant cette approche pas étudié l’efficacité au-delà de 12 semaines après la greffe de veine, plus ne pas évaluer l’efficacité au-delà de 4 semaines. En revanche, notre méthode réalise greffe veineuse continue de transgene expression qui persiste stable pendant au moins 24 semaines et axée sur les études similaires effectuées en artères-probablement beaucoup plus long22,24. Nous sommes au courant d’aucune autre veine greffon gène intervention orthophonique qui réalise l’expression du transgène stable de cette durée.
Nous avons utilisé un modèle de lapin pour développer notre méthode. D’autres ont utilisé des rongeurs, lapins, ou de plus grands animaux à veine d’essai de greffe génique thérapie10,11,12,15,16,17,25, 26. Par rapport aux modèles de rongeurs, les lapins sont plus chers et sont soumis à des exigences réglementaires plus strictes. Cependant, par rapport aux plus grands animaux (e.g., porcs et chiens), les lapins sont beaucoup moins cher à l’achat et la maison et beaucoup plus facile à gérer. En outre, vaisseaux du lapin ressemblent à des vaisseaux humains physiologiquement27, ils sont suffisamment importants, ils peuvent être utilisés pour l’essai des interventions percutanées28,29, qu’ils fournissent suffisamment tissu qui plusieurs points de terminaison (e.g., histologie, protéine, RNA) peuvent être examinées à l’aide d’un seul vaisseau sanguin spécimen22,30. En outre, lorsque les lapins avec veine greffes sont nourris avec une alimentation riche en graisses, elles développent veine greffon athérosclérose31,32, qui est une cause fréquente d’artères coronaires pontage veine greffon échec4,5 . Ces greffes de veine athéroscléreuse lapin peuvent servir comme un substrat pour l’essai des interventions de thérapie génique livrées avec cette méthode. Le protocole fourni peut aider les enquêteurs à maîtriser les compétences techniques nécessaires à la réalisation durable transgene expression dans les greffons de veine de lapin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des étapes cruciales dans le présent protocole comprennent la gestion de l’anesthésie, anticoagulation manipulation chirurgicale de la veine artère/greffés et mesures hémodynamiques de la veine greffée. Une bonne gestion de l’anesthésie est essentielle dans ce modèle de survie chirurgie multiple qui comprend deux opérations relativement longues (généralement de 3 à 3,5 h pour greffe veineuse bilatérale et 1,5 à 2,5 h de transduction greffe bilatérale). Nous avons administré de l’anesthésie par l?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
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