आम मन्या धमनी के लिए Jugular नस में टिकाऊ Transgene अभिव्यक्ति का एक खरगोश मॉडल भ्रष्टाचार
Summary
इस विधि खरगोशों में, भ्रष्टाचारियों के transduction, और टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति की उपलब्धि के स्थान नस भ्रष्टाचारियों की नियुक्ति का वर्णन है । यह transgenes की शारीरिक और रोग भूमिकाओं की जांच और उनके प्रोटीन उत्पादों को भ्रष्टाचारी नसों में, और नस भ्रष्टाचार रोग के लिए जीन उपचार के परीक्षण की अनुमति देता है ।
Abstract
नस भ्रष्टाचार बाईपास सर्जरी पूर्णावरोधक धमनी रोग के लिए एक आम उपचार है; हालांकि, दीर्घकालिक सफलता घनास्त्रता, intimal हाइपरप्लासिया, और atherosclerosis के कारण भ्रष्टाचार की विफलता द्वारा सीमित है । इस अनुच्छेद के लक्ष्य को एक खरगोश में द्विपक्षीय शिरापरक स्थिति भ्रष्टाचारों रखने के लिए एक विधि का प्रदर्शन है, तो एक जीन हस्तांतरण वेक्टर कि टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति प्राप्त के साथ भ्रष्टाचार transducing है । विधि सामान्य नस भ्रष्टाचार homeostasis में जीन की जैविक भूमिकाओं और उनके प्रोटीन उत्पादों की जांच की अनुमति देता है । यह भी गतिविधियों है कि नस भ्रष्टाचार विफलता को रोकने सकता है के लिए transgenes के परीक्षण की अनुमति देता है, उदाहरणके लिए, चाहे एक transgene की अभिव्यक्ति neointimal विकास रोकता है, संवहनी सूजन, कम कर देता है या खरगोशों में atherosclerosis कम हो जाती है खिलाया एक उच्च वसा वाले आहार के साथ । एक प्रारंभिक जीवन रक्षा सर्जरी के दौरान, सही और बाएं बाहरी jugular नस के खंडों और उत्पाद के रूप में रखा गया है द्विपक्षीय अंत के लिए साइड आम मन्या धमनी का किनारा भ्रष्टाचार के रूप में उलट । एक दूसरे अस्तित्व सर्जरी के दौरान, 28 दिनों के बाद प्रदर्शन किया, भ्रष्टाचारियों के प्रत्येक संवहनी क्लिप के साथ संचलन से अलग है और लुमेन (एक arteriotomy के माध्यम से) एक सहायक-निर्भर adenoviral (HDAd) वेक्टर युक्त समाधान के साथ भर रहे हैं । एक 20 मिनट की मशीन के बाद, वेक्टर समाधान aspirated है, arteriotomy की मरंमत की है, और प्रवाह बहाल है । नसों समय व्यक्तिगत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल द्वारा तय बिंदुओं पर काटा जाता है । भ्रष्टाचार के स्थान और transduction के बीच 28 दिन की देरी धमनी परिसंचरण के लिए नस भ्रष्टाचार के अनुकूलन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । इस अनुकूलन से पहले या तुरंत भ्रष्टाचार के बाद transduced नस भ्रष्टाचार में होता है कि transgene अभिव्यक्ति की तेजी से नुकसान से बचा जाता है । विधि अपने को भ्रष्टाचारी नसों में टिकाऊ, स्थिर transgene अभिव्यक्ति प्राप्त करने की क्षमता में अद्वितीय है । अंय बड़े जानवर नस भ्रष्टाचार के मॉडल की तुलना में, खरगोश कम लागत और आसान से निपटने के फायदे हैं । कुतर नस भ्रष्टाचार मॉडल की तुलना में, खरगोश बड़ा है और आसान करने के लिए हेरफेर रक्त वाहिकाओं कि विश्लेषण के लिए प्रचुर मात्रा में ऊतक प्रदान करते हैं ।
Introduction
Atherosclerosis एक पुरानी भड़काऊ बीमारी है जिसमें लिपिड संचय और रक्त वाहिका दीवार में सूजन पोत लुमेन के संकुचन के लिए सीसा, दिल के दौरे, स्ट्रोक, और अंगों की हानि1,2. Percutaneous हस्तक्षेप (जैसे, एंजियोप्लास्टी और स्टेंटिंग) और चिकित्सा थेरेपी (जैसे, statins और antiplatelet एजेंटों) atherosclerosis के लिए उपयोगी उपचार कर रहे हैं; हालांकि, वे अक्सर दोनों कोरोनरी और परिधीय संचलन में गंभीर प्रतिरोधी रोग के इलाज में अप्रभावी रहे हैं । बाईपास भ्रष्टाचार, autogenous नस क्षेत्रों का उपयोग, गंभीर, फैलाना कोरोनरी और परिधीय संवहनी रोग3,4के साथ रोगियों के इलाज के लिए एक आम प्रक्रिया बनी हुई है । हालांकि, नस दोनों कोरोनरी और परिधीय संचलनों में रखा भ्रष्टाचार दीर्घकालिक प्रत्यक्षता दरों गरीब है । कोरोनरी संचलन में, नस भ्रष्टाचार के लगभग 10-20% 1 साल में occluded है और ५०% 10 साल5,6से occluded हैं । परिधीय संचलन में, नस भ्रष्टाचार विफलता दर 5 साल7में 30-50% हैं ।
जीन थेरेपी नस भ्रष्टाचार की रोकथाम के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण है क्योंकि यह रोग की साइट पर ठीक एक चिकित्सीय जीन उत्पाद उद्धार कर सकते हैं । तदनुसार, कई नैदानिक अध्ययन नस भ्रष्टाचार जीन थेरेपी8,9का परीक्षण किया है । हालांकि, अनिवार्य रूप से इन अध्ययनों के सभी प्रारंभिक समय अंक (2-12 सप्ताह)10,11,12,13,14,15, पर प्रभावकारिता की जांच की है 16 , 17. हम कोई सबूत नहीं है कि जीन चिकित्सा हस्तक्षेप टिकाऊ (वर्ष) देर नस भ्रष्टाचार विफलता है कि आम तौर पर neointimal हाइपरप्लासिया और atherosclerosis4से परिणाम के खिलाफ संरक्षण प्रदान कर सकते है के बारे में पता कर रहे हैं । हम एक तरीका है कि भ्रष्टाचारी नसों में टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति की अनुमति देता है विकसित की है, और इस तरह की अनुमति देता है जीन के परीक्षण-चिकित्सा हस्तक्षेप देर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जल्दी समय अंक । टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, विधि HDAd वैक्टर और एक विलंबित transduction रणनीति शामिल है । HDAd वैक्टर लंबे समय तक transgene अभिव्यक्ति प्रदान क्योंकि वे वायरल जीन की कमी, मांयता (और transduced कोशिकाओं के प्रतिरक्षा प्रणाली18,19,20 द्वारा अस्वीकृति) को रोकने, 21. विलंबित transduction (प्रदर्शन 28 दिनों के बाद भ्रष्टाचार नियुक्ति) arterialization प्रक्रिया के दौरान transduced कोशिकाओं के नुकसान को रोकता है कि जल्दी से22भ्रष्टाचार के बाद होता है ।
नस भ्रष्टाचार की दीवार में चिकित्सीय transgene अभिव्यक्ति को प्राप्त करने वाले अन्य तरीकों में भ्रष्टाचार की नियुक्ति के समय नस भ्रष्टाचार के transduction पर निर्भर10,11,12,15,16 ,17. जब मापा प्रश्नपत्र, transgene अभिव्यक्ति इस दृष्टिकोण का उपयोग कर जल्दी transduction के बाद गिरावट आती है22,23। तदनुसार, इस दृष्टिकोण का उपयोग अध्ययनों से परे प्रभावकारिता की जांच नहीं की है 12 सप्ताह के बाद नस कलम बांधना, के साथ सबसे अधिक प्रभावकारिता का आकलन 4 सप्ताह से परे नहीं. इसके विपरीत, हमारी विधि नस भ्रष्टाचार transgene अभिव्यक्ति है कि कम से कम 24 हफ्तों के लिए छुरा बनी हुई है और इसी तरह की धमनियों में प्रदर्शन किया अध्ययन पर आधारित प्राप्त-संभावना अब तक जारी है22,24। हम कोई अंय नस भ्रष्टाचार जीन थेरेपी हस्तक्षेप है कि इस अवधि के स्थिर transgene अभिव्यक्ति प्राप्त के बारे में पता कर रहे हैं ।
हम एक खरगोश मॉडल इस्तेमाल के लिए हमारी विधि विकसित करना । दूसरों कुतर, खरगोश, या बड़ा जानवरों का उपयोग किया है नस भ्रष्टाचार जीन थेरेपी का परीक्षण10,11,12,15,16,17,25, 26. कुतर मॉडलों की तुलना में, खरगोश अधिक महंगे है और अधिक कठोर विनियामक आवश्यकताओं के अधीन हैं । हालांकि, बड़े जानवरों की तुलना में (जैसे, सूअर और कुत्ते), खरगोशों अभी तक कम खरीद और घर और अधिक आसान संभाल करने के लिए महंगा है । इसके अलावा, खरगोश जहाजों मानव वाहिकाओं शारीरिक रूप से समान27, वे पर्याप्त बड़े है कि वे percutaneous हस्तक्षेप28,29के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और वे पर्याप्त ऊतक प्रदान करते है कि एकाधिक अंतिमबिंदु (जैसे, प्रोटोकॉल, प्रोटीन, आरएनए) एक एकल रक्त वाहिका नमूना22,30का उपयोग कर जांच की जा सकती है । इसके अलावा, जब नस भ्रष्टाचार के साथ खरगोश एक उच्च वसा वाले आहार के साथ खिलाया जाता है, वे नस भ्रष्टाचार atherosclerosis31,३२है, जो कोरोनरी धमनी बाईपास नस भ्रष्टाचार का एक आम कारण है विकसित की विफलता4,5 . इन atherosclerotic खरगोश नस भ्रष्टाचार इस पद्धति के साथ दिया जीन चिकित्सा उपायों के परीक्षण के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में सेवा कर सकते हैं । प्रदान की प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को खरगोश नस भ्रष्टाचार में टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए आवश्यक तकनीकी कौशल मास्टर करने के लिए मदद कर सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम संज्ञाहरण, एंटिकोगुलेशन, धमनी की शल्य चिकित्सा हेरफेर के प्रबंधन में शामिल हैं, और भ्रष्टाचार नस की hemodynamic माप । संज्ञाहरण के उचित प्रबंधन के इस कई अस्तित्व सर्जरी मॉडल ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
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