Un modelo de conejo de expresión del transgen Durable en la vena yugular a los injertos de interposición de la arteria carótida común
Summary
Este método describe la colocación de injertos de interposición de la vena en conejos, la transducción de los injertos y el logro de la expresión del transgen resistente. Esto permite la investigación de funciones fisiológicas y patológicas de los transgenes y sus productos proteicos en las venas injertadas y pruebas de terapias genéticas para la enfermedad de injerto de vena.
Abstract
Cirugía de bypass de vena del injerto es un tratamiento común para la enfermedad arterial oclusiva; sin embargo, el éxito a largo plazo está limitada por la falta del injerto por trombosis, hiperplasia intimal y aterosclerosis. El objetivo de este artículo es demostrar un método para colocar injertos de interposición venosa bilateral en un conejo, luego transducing los injertos con un vector de transferencia génica que alcanza expresión transgen resistente. El método permite la investigación de las funciones biológicas de los genes y sus productos de proteína en la homeostasis de injerto de vena normal. También permite la prueba de transgenes para las actividades que podrían evitar el fracaso del injerto de vena, por ejemplo., si la expresión de un transgen previene el crecimiento neointimal, reduce la inflamación vascular y reduce la aterosclerosis en conejos alimentados con una dieta alta en grasas. Durante una cirugía inicial de supervivencia, los segmentos de la vena yugular externa izquierda y derecha son suprimidos y colocados bilateralmente como invertida fin-a-lado de la arteria carótida común interposición injertos. Durante una segunda cirugía de supervivencia, realizada 28 días después, cada uno de los injertos es aislado de la circulación con clips vasculares y los lúmenes están llenos (a través de una arteriotomía) con una solución que contiene un vector adenoviral de (HDAd) dependiente de la ayuda. Después de una incubación de 20 min, se aspira la solución del vector, se repara la arteriotomía y se restaura el flujo. Las venas son cosechadas en momentos de protocolos experimentales individuales. El retraso de 28 días entre la colocación del injerto y la transducción de señales es necesario para asegurar la adaptación del injerto de la vena a la circulación arterial. Esta adaptación evita la rápida pérdida de transgene expresión que ocurre en injertos de vena transduced antes o inmediatamente después de injertar. El método es único en su capacidad para lograr la expresión del transgen durable, estable en las venas injertadas. En comparación con otros modelos de injerto de vena de animal grande, los conejos tienen ventajas de bajo costo y fácil manejo. En comparación con modelos de injerto de vena roedores, los conejos tienen vasos más grandes y más fácil de manipular que proporcionan abundante tejido para análisis.
Introduction
La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica en la que acumulación del lípido y la inflamación en la pared de los vasos sanguíneos conducen a estrechamiento del lumen del vaso, ataques cardíacos, trazos y pérdida de extremidades1,2. Intervenciones percutáneas (por ej., angioplastia y stenting) y terapia médica (e.g., agentes estatinas y antiagregantes) son tratamientos útiles para la ateroesclerosis; sin embargo, a menudo son ineficaces en el tratamiento de enfermedad obstructiva severa tanto en las circulaciones coronarias y periféricas. Injertos de derivación, con segmentos de vena autógena, sigue siendo un procedimiento común para el tratamiento de pacientes con enfermedad vascular periférica y coronaria severa, difusa3,4. Sin embargo, la vena injertos colocados en ambos la coronaria y circulaciones periféricas tienen pobres tasas de permeabilidad a largo plazo. En la circulación coronaria, aproximadamente 10-20% de los injertos se ocluyen en 1 año y 50% de la vena se ocluyen por 10 años5,6. En la circulación periférica, las tasas de fracaso del injerto de la vena son 30-50% en 5 años7.
La terapia génica es un método atractivo para la prevención de fracaso del injerto de vena porque puede entregar un producto del gene terapéutico precisamente en el sitio de la enfermedad. En consecuencia, numerosos estudios preclínicos han probado la vena del injerto gene terapia8,9. Sin embargo, esencialmente todos estos estudios han examinado la eficacia en el temprano tiempo puntos (2-12 semanas)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. somos conscientes de ninguna evidencia de que intervenciones de terapia del gene pueden proporcionar una duradera protección (años) contra el último fracaso del injerto de vena que típicamente resulta de neointimal hiperplasia y aterosclerosis4. Hemos desarrollado un método que permite la expresión del transgen durable en las venas injertadas y así permite la prueba de las intervenciones de terapia génica en momentos finales y principios. Para lograr la expresión del transgen durable, el método incorpora HDAd vectores y una estrategia de transducción retrasada. Vectores de HDAd proporcionan expresión transgénica prolongada porque carecen de genes virales, evitar el reconocimiento y rechazo de células transduced por el sistema inmune18,19,20, 21. transducción retrasado (realizadas 28 días después de la colocación de un injerto) previene la pérdida de células transduced durante el proceso de arterialización que ocurre pronto después del injerto22.
Otros métodos que alcanzan expresión transgen terapéutico en la pared de la vena del injerto se basan en la transducción del injerto de vena en el momento del injerto colocación10,11,12,15,16 ,17. Cuando se mide en serie, expresión del transgen mediante este enfoque declina rápidamente después de la transducción de la22,23. Por consiguiente, desde este enfoque los estudios no han examinado la eficacia más allá de 12 semanas tras el injerto de vena, con más no evaluaban eficacia más allá de 4 semanas. En cambio, nuestro método logra injerto vena transgene expresión que persiste estable durante al menos 24 semanas y basados en estudios similares realizados en arterias probablemente continúa mucho más de22,24. Somos conscientes de ninguna otra vena injerto gene terapia intervención que alcanza expresión del transgén estable de esta duración.
Hemos utilizado un modelo de conejo para desarrollar nuestro método. Otros han utilizado roedores, conejos o animales más grandes para poner a prueba la vena del injerto gene terapia10,11,12,15,16,17,25, 26. En comparación con modelos de roedores, los conejos son más caros y están sujetos a requisitos regulatorios más estrictos. Sin embargo, en comparación con los animales más grandes (por ej., cerdos y perros), los conejos son mucho menos caros de comprar y de la casa y mucho más fácil de manejar. Por otra parte, buques de conejo se asemejan a los vasos humanos fisiológicamente27, son lo suficientemente grandes que pueden ser utilizados para las pruebas de intervencionismo percutáneo28,29, y proporcionan suficiente tejido que múltiples criterios de valoración (e.g., histología, RNA de la proteína) puede ser examinado usando un solo vaso sanguíneo muestra22,30. Además, cuando los conejos con injertos venosos son alimentados con una dieta alta en grasas, se convierten de la vena del injerto aterosclerosis31,32, que es una causa común de la arteria coronaria bypass vena del injerto fracaso4,5 . Estos injertos de vena de conejo aterosclerótica pueden servir como sustrato para las intervenciones de terapia génica con este método de prueba. El protocolo siempre puede ayudar a los investigadores a dominar las habilidades técnicas necesarias para lograr la expresión del transgen durable en injertos de vena de conejo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos en este protocolo incluyen la administración de la anestesia, manipulación de anticoagulación, cirugía de la vena arteria/injertado y medidas hemodinámicas de la vena injertada. Adecuado manejo de la anestesia es fundamental en este modelo de cirugía supervivencia múltiple que incluye dos operaciones relativamente largo (típicamente 3-3.5 h para injerto bilateral de la vena y 1.5-2.5 h para la transducción de injerto bilateral). Hemos administrado anestesia mediante una ojiva y por intubación en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
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