Fabrikasjon av tungen ekstracellulær Matrix og rekonstituering tungen Squamous celle Carcinoma In Vitro
Summary
En metode er vist her for utarbeidelse av tungen ekstracellulær matrix (TEM) med effektiv decellularization. TEM kan brukes som funksjonell stillaser for gjenoppbyggingen av tungen squamous celle carcinoma (TSCC) modell under statisk eller rørt kultur forhold.
Abstract
For å bygge en effektiv og realistisk modell for tunge squamous celle carcinoma (TSCC) i vitro, ble metodene skapt til å produsere decellularized tunge ekstracellulær matrix (TEM) som funksjonell stillaser TSCC konstruksjon. TEM gir en i vitro nisje for cellevekst, differensiering og celle migrasjon. Microstructures opprinnelige ekstracellulær matrix (ECM) og biokjemiske komposisjoner beholdes i decellularized matrise inneholder vev-spesifikke nisjer for forankring celler. Fabrikasjon av TEM kan realiseres ved deoxyribonuclease (DNase) fordøyelsen sammen med en alvorlig av organisk eller uorganisk forbehandling. Denne protokollen er enkel å betjene og sikrer høy effektivitet for decellularization. TEM viste gunstig cytocompatibility for TSCC celler under statisk eller rørt kultur forhold, som gjør at byggingen av TSCC modellen. En Self-Made bioreactor ble også brukt for vedvarende rørt betingelsen for cellekultur. Rekonstruert TSCC bruker TEM viste egenskaper og egenskaper ligner klinisk TSCC histopatologi, tyder potensialet i TSCC forskning.
Introduction
Tungen har ulike viktige funksjoner som deglutition, artikulasjon og smaker. Dermed har svekkelse av tungen funksjonen stor innvirkning på pasienter livskvalitet1. Den vanligste kreft i munnhulen er tunge squamous celle carcinoma (TSCC), som vanligvis skjer i mennesker som drikker alkohol eller røyke tobakk2.
De siste årene, har liten fremgang blitt oppnådd i grunnforskning på TSCC. Mangel på effektiv i vitro forskning modeller gjenstår å være en av de største problemene. Dermed viser den ekstracellulære matrisen (EFM) seg for å være en potensiell løsning. Siden ECM er et komplekst nettverk ramme består av svært organiserte matrix komponenter, vil skafottet materialer har en ECM-lignende struktur og sammensetning være kompetent til kreftforskning. Decellularized ECM gir perfekt nisje for cellene fra samme opprinnelse i vitro, som viser seg for å være den viktigste fordelen av ECM.
ECM kan beholdes med cellulære komponenter fjernet fra vev gjennom decellularization vaskemidler og enzymer. Ulike ECM-komponenter, inkludert kollagen, fibronectin og laminin i decellularized matrise gir kulturperler celler, fremme den overlevelse, spredning og differensiering cellene3en innfødt-vev som microenvironment. Videre reduseres immunogenisitet for transplantasjon til et minimalt nivå med fravær av cellulære komponenter i ECM.
Så langt, har fabrikasjon metoder for decellularized ECM vært prøvd i ulike vev og organer, som hjertet4,5,6,7, lever8,9,10 ,11, lunge12,13,14,15,16,17og nyre18,19 , 20. ingen relevante forskning har imidlertid finnes på tilsvarende arbeid i tungen til best av vår kunnskap.
I denne studien, ble decellularized tunge ekstracellulær matrix (TEM) fabrikkert både effektiv og billig en rekke fysiske, kjemiske og enzymatiske behandling. Deretter ble TEM brukt til recapitulate TSCC i vitro, viser en riktig simulering for TSCC atferd og utvikling. TEM har god biocompatibility samt muligheten til å veilede cellene til vev-spesifikk nisje, som angir at TEM kan ha stort potensial i TSCC forskning3. Protokollen vises her gir et valg for forskere studere patogenesen eller klinisk behandling av TSCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
En godt etablert protokoll decellularized ECM fabrikasjon bør beholde opprinnelige ECM sammensetningen mens fjerne cellulære komponenter i vev nesten helt21. Til tross for øyeblikket rapporterte decellularization protokoller som krever perfusjon gjennom blodkar fjerne cellulære materialer med konvektive transport, ble mekanisk agitasjon vedtatt her, kjent som en tradisjonell enkel og billig metode22 , 23 , …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne bekrefter støtte fra forskningsmidler fra National Natural Science Foundation i Kina (31371390), programmet av statlige høyteknologiske utbyggingsprosjektet (2014AA020702) og programmet Guangdong vitenskap og teknologi (2016B030231001).
Materials
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
- Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
- Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
- Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
- Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
- Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
- Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
- Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).
