طريقة بسيطة لعزل بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيق لتحليل التعبير الجيني عابر
Summary
قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وفعالة لإعداد كميات كبيرة من فول الصويا بروتوبلاستس لدراسة آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية.
Abstract
فول الصويا (ماكس جليكاين (لام) مير.) هو أنواع محاصيل هامة، وأصبحت نموذجا البقول للدراسات الخاصة بالمسارات الجينية والبيوكيميائية. ولذلك، من المهم إقامة نظام تعبير الجيني عابر فعالة في فول الصويا. هنا، نحن تقرير بروتوكول بسيط لإعداد بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيقه للتحليلات الفنية عابرة. ووجدنا أن يترك أونيفولياتي الشباب من بذور فول الصويا أدى إلى كميات كبيرة من بروتوبلاستس عالية الجودة. عن طريق تحسين أسلوب تحويل الكالسيوم توسطت شماعة، حققنا التحول عالية الكفاءة باستخدام فول الصويا أونيفولياتي بروتوبلاستس. هذا النظام يوفر نموذج كفاءة وتنوعاً للنظر في آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية من فول الصويا، وقد تساعد على تحسين فهم العمليات الخلوية والتنموية والفسيولوجية المتنوعة من البقوليات.
Introduction
بروتوبلاستس هي الخلايا النباتية التي تحتوي على جدران الخلايا إزالة. كما يحتفظون بمعظم الميزات وأنشطة الخلايا النباتية، بروتوبلاستس هي نظام نموذجا جيدا لمراقبة وتقييم الأحداث الخلوية المتنوعة، وهي أدوات قيمة لدراسة تهجين جسمية1 ومصنع التجدد2. بروتوبلاستس على نطاق واسع أيضا استخدمت محطة التحول3،،من45، نظراً لجدران الخلايا إلا تعرقل مرور الحمض النووي في الخلية. بروتوبلاستس تمتلك بعض الاستجابات الفسيولوجية والعمليات الخلوية للنباتات سليمة، ومن ثم تقديم قيمة أساسية في البحوث الأساسية لدراسة البروتين سوبسيلولار التعريب6،،من78، يعيش البروتين-بروتين تفاعلات9،10، ومروج النشاط11،،من1213 في الخلايا.
عزل محطة بروتوبلاستس أبلغ أولاً في عام 196014 وقد وضعت بروتوكولات للعزلة والتحول من بروتوبلاستس ومحسن. إجراءات موحدة لعزل جبلة مجردة ينطوي على قطع أوراق الشجر والهضم الأنزيمي لجدران الخلية، متبوعاً بالفصل بين بروتوبلاستس المفرج عنهم من الحطام الأنسجة غير هضمها. وتشمل استراتيجيات التحول انهانسر15،16،17،microinjection18، والمستندة إلى البولي إثيلين غليكول (شماعة)4،5،19 أساليب. وأبلغ مجموعة واسعة من الأنواع الناجحة لعزل جبلة مجردة، بما في ذلك الحمضيات20وكرنب21، الباذنجانية22 و23،أسر أخرى من نباتات الزينة24. بينما يتم استخدام أنواع الأنسجة المتنوعة في مختلف الأنواع، نظام التعبير عابر في نبات mesophyll جبلة مجردة (تيمب) المعزولة من أوراق النبات نموذج التمويل نبات كانت راسخة25 واعتمدت على نطاق واسع لتطبيقات متنوعة.
فول الصويا (ماكس جليكاين (L.) Merr.) واحد من أهم البروتين ومحاصيل النفط26. وخلافا نبات الأرز، والحصول على نباتات فول الصويا المعدلة وراثيا المعروف أن صعبة بل ومنخفضة الكفاءة. Tumefaciens المتبعة-قد استخدم تسلل وساطة شعبيا لدراسات التعبير الجيني عابر في خلايا البشرة في27 من التبغ وشتلة في نبات،من2829، في حين وقد استخدمت رهيزوجينيس المتبعة لتحول جذور شعر في30من فول الصويا. استخدمت دوونريجوليشن31،الجينات المستهدفة32 وعابرة التعبير33 نهج إسكات الجينات الناجمة عن الفيروس بطريقة منهجية. بروتوبلاستس توفر بديلاً قيماً وتنوعاً لهذه النهج. ويمكن الحصول على مواد سطحي لفول الصويا بروتوبلاستس والسماح بالتعبير التحوير سريعة ومتزامنة. ومع ذلك، عزل بروتوبلاستس فول الصويا في عام 198334الناجحة الأولى، هناك منذ التقارير المحدودة على تطبيق بروتوبلاستس في فول الصويا35،،من3637، 38، أساسا بسبب المحاصيل منخفضة نسبيا من فول الصويا بروتوبلاستس.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول بسيط وفعال للعزلة من فول الصويا بروتوبلاستس وتطبيقه لدراسات التعبير الجيني عابر. استخدام أوراق أونيفولياتي الشباب من بذور فول الصويا، كنا قادرين على الحصول على كميات كبيرة من بروتوبلاستس الحيوية في غضون ساعات قليلة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن الأمثل طريقة تحول الكالسيوم توسطت شماعة بسيطة ومنخفضة التكلفة إيصال الحمض النووي في بروتوبلاستس فول الصويا بكفاءة عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول لعزل بروتوبلاستس فول الصويا والتطبيق لدراسات التعبير عابر قد تم اختبارها بدقة، ويعمل بشكل جيد للغاية في المختبر. الإجراءات بسيطة وسهلة، وتتطلب معدات عادية وأقل تكلفة. لدينا بروتوكول ينتج كميات كبيرة من بروتوبلاستس موحدة وعالية الجودة بالمقارنة مع أساليب سبق الإبلاغ عنها<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل “برنامج بحوث الجينوم المصنع” من “المؤسسة الوطنية للعلوم” (NSF–بجرب–دائرة الرقابة الداخلية–1339388).
Materials
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Koop, H. -. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
- Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
- Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
- Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
- Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
- Wu, F. -. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16 (2009).
- Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
- Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
- Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
- Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
- Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
- Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
- Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
- Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
- Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
- Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
- Grun, P., Chu, L. -. J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
- Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
- Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14 (2012).
- Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).
- Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
- Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
- Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
- Wu, H. -. Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19 (2014).
- Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
- Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
- Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
- Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
- Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
- Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
- Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).
- Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
- Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).
