콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

Summary

우리는 라이브 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘을 연구를 많은 양의 콩 protoplasts의 준비를 위한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발.

Abstract

콩 (최대 글리신 (L.) Merr.)는 중요 한 작물 종 이며 유전 그리고 생 화 확 적인 통로의 연구에 대 한 콩과 모델 되고있다. 따라서, 그것은 콩에서 효율적인 변이 유전자 표현 시스템을 설정 하는 것이 중요입니다. 여기, 우리 콩 protoplasts의 준비에 대 한 간단한 프로토콜 및 일시적 기능 분석에 대 한 응용 프로그램을 보고합니다. 우리는 젊은 unifoliate 잎 콩 모 종에서 높은 품질 protoplasts의 대량에서 결과 발견. 못 칼슘 중재 하는 변환 메서드를 최적화 하 여 우리 콩 unifoliate protoplasts를 사용 하 여 높은 변환 효율을 달성. 이 시스템 라이브 콩 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘의 검사에 대 한 효율적이 고 다재 다능 한 모델을 제공 하 고 더 나은 하는 데 도움이 콩의 다양 한 세포, 발달 및 생리 적 프로세스를 이해할 수 있습니다.

Introduction

Protoplasts는 식물 세포는 세포 벽 제거. 그들은 대부분의 기능을 유지 하 고 식물 세포의 활동, protoplasts는 관찰 하 고 평가 하는 다양 한 세포 이벤트, 좋은 모델 시스템 하 고 체세포 혼성¹ 을 공부 하 고 중생²공장에 유용한 도구. Protoplasts 공장 변환^3,,45, 세포 벽 세포로 DNA의 통로 차단 그렇지 않으면 이후 널리 이용 되어 있다. Protoplasts 생리 적인 응답의 일부 및 따라서 단백질 subcellular 지 방화^6,7,8, 공부 하는 기초 연구에 근본적인 가치를 제공 하 고 그대로 식물의 세포 프로세스 보유 단백질 단백질 상호 작용^9,10, 발기인 활동^11,

Protocol

1입니다. 식물의 성장

1. 콩에 대 한 사용자 지정 토양 혼합에 25 ° C에서 긴 하루 조건 (16 h 1500 µmol m^{-2의 -1}에 빛)에서 온실에서 13cm 냄비에 5-10 콩 씨앗 (윌리엄스 82)를 뿌리 다 (1: 토양, 진주 암 및 어 뢰 모래의 비율이 1:1).

2입니다. 플라스 미드 DNA의 준비

1. 살 균 피 펫 팁 또는 이쑤시개 사용 하, 단일 식민지 또는 냉동된 글리세롤 재고의 대장균 의 유전자를 포함 하는 플라스 미드를 운반 하 고 20 mL 50 mL 플라스 크에 적절 한 항생제와 Luria Bertani (파운드) 액체 매체에 접종.
2. 통에 하룻밤 37 ° C에서 플라스 크를 품 어. 5 분 동안 실 온에서 12000 x g에서 정지 centrifuging와 삭제는 상쾌한 박테리아를 수집 합니다. 추출 하 고 플라스 미드 플라스 미드 준비 장비의 제조 업체의 절차에 따라 정화.

3. 원생 동물 격리

1. 10 일 된 콩 모 종 (그림 1)에서 새로 확장 된 unifoliate 나뭇....

Results

다른 장기 10 일 오래 된 콩의 원생 동물 준비 (그림 1)에 대 한 테스트 및 수율 (그림 2) 현미경 관찰 했다. Hypocotyl 및 epicotyl에서 세포 벽 거의 소화 했다, 하 고 일부 셀 (그림 2B, 2 C) 서로 게 연결 된. 떡 (그림 2D)와 루트 (그림 2A), 세포 벽은 세포의 작은 부분에만 제거 되었습니다. 반면, 많은 수의 protoplasts unifoliate 때 관찰 되었다 (그림 2E-G)을 사용. 다른 발달 단계에서 unifoliate 잎 시험된 (

Discussion

콩 protoplasts 및 과도 식 연구에 응용 프로그램의 격리에 대 한이 정서의 철저 하 게 테스트 하 고 우리의 실험실에서 아주 잘 작동. 절차는 간단 하 고 쉽게 고 일반 장비 및 최소 비용 요구. 우리의 프로토콜 이전에 보고 된 방법^{34,35,36,,3738}에 비해 균일 한 고품질 protoplasts의 대량을 생성 합니다. 그러나, 원생 동물 수율과 변환 속도 영향을 미칠 많은 요인이 있기 때문에, 그것은 좋습니다 연구자의 실험 조건, 바람직한 결과 사용 되는 재료에 따라 조건 최적화에 대 한. 이 시스템은 식물 세포에 즉시 규제 및 생 화 확 적인 사건의 검사를 위해 아주 유용 하다, 그러나 장기 세포 프로세스 및 조직 또는 o.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Sigma Aldrich	M8250-100G
셀룰라아제 CELF	Worthington Biological Corporation	LS002611
Pectolyase Y-23	BioWorld	9033-35-6
셀룰라아제 "ONOZUKA" R-10	야쿠르트	10g
MACEROZYME R-10	야쿠르트	10g
만니톨	ICN 생물 의학	152540
CaCl2	Fisher	C79-500g
BSA	NEB	R3535S
DTT	시그마 Aldrich	D5545-5G
NaCl	시그마 Aldrich	S7653-1kg
KCl	Fisher	P217-500g
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100g
PEG4000	Fluka	81240
나일론 메쉬	캐롤라이나	652222N
조직 배양 플레이트	USA Scientific	CC7682-7506
면도날	Fisher	12-640
혈구계	hausserscientific	1483
QIAprep 스핀 Miniprep 키트	Qiagen	27104
EZNA 플라스미드 miniprep kit	Omega	D6942-01
GeneJET 플라스미드 Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Centrifuge 5810	eppendorf	5811000827
Centrifuge 5424	eppendorf	22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet Controller	Jencons	14526-202
Zeiss 710 컨포칼 현미경	Zeiss	N/A
Nonstick, RNase-free 마이크로fuge 튜브, 1.5mL	Ambion	AM12450
15mL 원심분리기 튜브	Denville	C1018-P
50mL 원심분리기 튜브	Denville	C1060-P
신생아 송아지 혈청	Thermo Scientific	16010159
토양	Ingram's Nursery
perlite	Vigoro	100521091
Torpedo Sand	JKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder)	Fisher	BP1427-500