En enkel metode for isolering av soyabønner Protoplasts og programmet forbigående Gene Expression analyser

Summary

Vi utviklet en enkel og effektiv protokoll for utarbeidelse av store mengder soyabønner protoplasts å studere komplekse regulatoriske og signalnettverk mekanismer i levende celler.

Abstract

Soyabønner (Glycine max (L.) Merr.) er en viktig avling og har blitt en legume modell for studier av genetiske og biokjemiske. Derfor er det viktig å etablere en effektiv forbigående gene expression system i soyabønner. Her rapporterer vi en enkel protokoll for utarbeidelse av soyabønner protoplasts og programmet for forbigående funksjonelle analyser. Vi fant at unge unifoliate blader fra soybean frøplanter resulterte i store mengder av høykvalitets protoplasts. Ved å optimalisere en PEG-kalsium-mediert transformasjon metoden, oppnådd vi høye transformasjon effektivitet ved hjelp soyabønner unifoliate protoplasts. Dette systemet gir en effektiv og allsidig modell for undersøkelse av komplekse regulatoriske og signalnettverk mekanismer i live soyabønner celler og kan bidra til å bedre forstå ulike mobilnettet, utviklingsmessige og fysiologiske prosesser av belgfrukter.

Introduction

Protoplasts er anlegget celler som har cellevegger fjernet. De vedlikeholde det meste av funksjoner og aktiviteter i anlegget celler, protoplasts er en god modell å observere og vurdere ulike mobilnettet arrangementer, og er verdifulle verktøy å studere somatisk hybridiseringen¹ og plante gjenfødelse². Protoplasts har vært også mye benyttet for plante transformasjon^3,4,5, siden cellevegger ellers blokkere passasjen av DNA i cellen. Protoplasts har noen av de fysiologiske responser og cellulære prosesser intakt planter, derfor tilbyr grunnleggende verdien i grunnleggende forskning til å studere subcellular protein lokalisering^6,7,8, Protein-protein interaksjoner^9,10og promoter aktivitet^11,12,13 i lever celler.

Isolasjon av anlegget protoplasts ble først rapportert i 1960¹⁴ og protokollene for både isolasjon og transformasjonen av protoplasts er utviklet og optimalisert. En standard prosedyre protoplast isolasjon innebærer skjæring av blader og enzymatiske fordøyelsen av cellevegger, etterfulgt av separasjon av utgitt protoplasts fra ikke-fordøyd vev rusk. Transformasjon strategier inkluderer electroporation^15,16, microinjection^17,18og polyetylenglykol-basert (PEG)^4,5,19 metoder. En rekke arter har rapportert vellykket for protoplast isolasjon, inkludert sitrus²⁰, Brassica²¹, Solanaceae²² og andre dekorative plant familier^23,24. Mens ulike vev brukes i ulike arter, er et system av forbigående uttrykk i Arabidopsis mesophyll protoplast (TEAMP) isolert fra bladene av modellen anlegget Arabidopsis thaliana godt etablert²⁵ og vidt vedtatt å forskjellige programmer.

Soyabønner (Glycine max (L.) Merr.) er en av de viktigste protein og olje avlinger²⁶. I motsetning Arabidopsis og ris, er skaffe transgene soyabønner planter kjent for å være ganske vanskelig og lav effektivitet. Agrobacterium tumefaciens-mediert infiltrasjon har blitt populært brukt for forbigående gene expression studier i epidermal cellene i tobakk²⁷ og planter i Arabidopsis^28,29, mens Agrobacterium rhizogenes har blitt brukt for transformasjon av hårete røtter i soyabønner³⁰. Forårsaket av virus genet stanse tilnærminger har blitt benyttet for downregulation målet gener^31,32 og forbigående uttrykk³³ i en systemisk måte. Protoplasts gir en verdifull og allsidig alternativ til disse tilnærmingene. Protoplasts kan fås fra soyabønner aboveground materialer og tillate rask og synkronisert transgene uttrykk. Men siden den første vellykkede isolering av soyabønner protoplasts i 1983³⁴, har det vært begrenset rapporter på anvendelse av protoplasts i soyabønner^{35,36,37, 38}, hovedsakelig på grunn av relativt lav avkastning på soyabønner protoplasts.

Her beskriver vi en enkel og effektiv protokoll for isolering av soyabønner protoplasts og programmet for forbigående gene expression studier. Bruker unge unifoliate blader fra soybean frøplanter, kunne vi få store mengder av avgjørende protoplasts i noen timer. Dessuten, har vi optimalisert en PEG-kalsium-mediert transformasjon metode som er enkelt og rimelig å levere DNA i soyabønner protoplasts med høy effektivitet.

Protocol

1. vekst av planter Så 5-10 soyabønner frø (Williams 82) i en 13 cm pott i drivhuset under lange dager forhold (16 h lys på 1500 µmol m-2 s-1) ved 25 ° C på egendefinerte jord blanding for soyabønner (1:1:1 ratio med jord, perlitt og torpedo sand). 2. utarbeidelse av plasmider DNA Bruke et sterilt pipette tips eller tannpirker, Velg en enkelt koloni eller frosne glyserol lager av E. coli bærer plasmider inneholder genet av inter…

Representative Results

Ulike organer av 10 – dagers gammel soyabønner ble testet for protoplast forberedelse (figur 1) og gir ble observert under mikroskopet (figur 2). Cellevegger fra hypocotyl og epicotyl var knapt fordøyd, og noen celler ble festet til hverandre (figur 2B, 2 C). I cotyledon (figur 2D) og roten (figur 2A), ble cellevegger fjer…

Discussion

Denne protokollen for isolering av soyabønner protoplasts og programmet forbigående uttrykk studier har blitt grundig testet og fungerer godt i vårt laboratorium. Fremgangsmåten er enkel og lett og krever vanlig utstyr og minimale kostnader. Våre protokollen gir store mengder ensartet, høy kvalitet protoplasts i forhold til tidligere rapportert metoder,^34,,^35,,^36,,^37,,<sup clas…

Materials

MES	Sigma Aldrich	M8250-100G
Cellulase CELF	Worthington Biological Corporation	LS002611
Pectolyase Y-23	BioWorld	9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10	yakult	10g
MACEROZYME R-10	yakult	10g
Mannitol	ICN Biomedicals	152540
CaCl2	Fisher	C79-500g
BSA	NEB	R3535S
DTT	Sigma Aldrich	D5545-5G
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-1kg
KCl	Fisher	P217-500g
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100g
PEG4000	Fluka	81240
nylon mesh	carolina	652222N
Tissue Culture Plates	USA Scientific	CC7682-7506
Razor Blades	Fisher	12-640
hemacytometer	hausserscientific	1483
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
EZNA plasmid miniprep kit	Omega	D6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Centrifuge 5810	eppendorf	5811000827
Centrifuge 5424	eppendorf	22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet Controller	Jencons	14526-202
Zeiss 710 Confocal Microscope	Zeiss	N/A
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450
15 mL Centrifuge Tubes	Denville	C1018-P
50 mL Centrifuge Tubes	Denville	C1060-P
Newborn Calf Serum	Thermo Scientific	16010159
Soil	Ingram's Nursery
perlite	Vigoro	100521091
Torpedo Sand	JKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder)	Fisher	BP1427-500