이 문서에서는, endomyocardial bioptic 샘플의 arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 mesenchymal stromal 세포를 분리 하는 방법을 제공 됩니다. 그들의 특성 및 그들의 adipogenic 차별화를 강화 하는 프로토콜을 설명 합니다.
정상적인 성인 심장 중 심장 mesenchymal stromal 세포는 풍부한 인구를 대표 하는 여러 다른 세포 유형, 구성 됩니다. 이러한 셀의 심장 질병에 그들의 참여의 가능성을 제공 하 고, 또한, 생물 학적 메커니즘을 조사 하는 유용한 1 차 셀 모델을 제공 합니다.
여기, arrhythmogenic 심근 환자의 bioptic 샘플에서 C-MSC의 격리에 대 한 방법을 설명 합니다. Endomyocardial 생 검 샘플링 전기 해부학 매핑에서 시각 흉터에 인접 한 오른쪽 심 실 지역에서 가이드입니다. 콜라와 C-MSC 성장 수 있도록 문화 매체에서 플라스틱 접시에 그들의 도금 biopsies의 소화 설명 되어 있습니다. 몇 구절에 대 한 문화에서 고립 된 셀을 확장할 수 있습니다. 확인 하 고 그들의 엽 형, 면역 phenotypical 특성의 설명 제공 됩니다. C-MSC adipocytes, chondrocytes, osteoblasts 같은 여러 세포 유형으로 분화 할 수 있다: 맥락에서 ACM의, 환자의 마음에 체형 예금, C-MSC의 adipogenic 차별화에 대 한 프로토콜 특징 및 지질 방울 축적의 특성을 설명 합니다.
중간 엽 기질 세포 (MSC)는 많은 조직1에 중요 한 지원 기능을 가진 성인 세포 이다. 골, MSC의 역사적 소스 하지만 그들은 태 반, 지방 조직, 탯 줄 혈액, 간, 그리고 심장1,2를 포함 하 여 다른 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다.
2006 년에, 국제 사회에 대 한 세포 치료 (ISCT) 지정, 처음으로 인간 MSC3를 정의 하는 최소한의 조건을. 특히, MSC 플라스틱을 준수 하는 능력을가지고 있어야 합니다. 그들은 특정 표면 항 원 표현:는 양성 CD44, CD105, CD29, CD90 엽 마커 및 부정적 CD14, CD45, CD34, CD31 조 혈과 내 피 마커 특징 MSC. HLA-DR의 부족 표현으로 인해 MSC는 alloreactivity를 실행할 수 수 없습니다. 또한, 그들은 adipogenic, chondrocyte, 및 osteoblast 계보1,3으로 차별화 하는 잠재력을 가진 multipotent 셀.
심장 세포 구성에 초점을 맞추고, 심장 중간 엽 기질 세포 (C-MSC) 정상적인 성인 심장4,5에서 풍부한 있습니다. 그들은 모두 정상적인 심장 기능 및 병 적인 조건에 중요 한 역할. 순수, 심근의 구조 및 기능적 무결성을 지 원하는 microenvironment를 제공 하는 C-MSC, 심장 질환에서 그들은 상처 치유와6을 개장 하는 거리에 참여 하는 심장 부상에 대 한 응답에서 활성화 됩니다 ,7.
최근, arrhythmogenic 심근 (ACM) 지방 대체에서 C-MSC의 참여 시연된8되었습니다. 특히, ACM 주로 우 심 실9에서 주로 심근 fibro 지방산 보충 하는 desmosomal 유전자에 있는 돌연변이 의해 발생 하는 유전 질환 이다. Endocardium, epicardium에서 연장 하는이 대체 비 전도성 기판 elicits 진보적인 심장 마비를 악화, 심한 경우, 갑작스런 죽음에 지도할 수 있는 심 실 부정맥을 만듭니다. Sommariva 외. 시연 사전 adipocytes의 간 엽 기원 ACM 환자의 explanted 심장 섹션에 존재. 또한, C-MSC ACM 마음 익스프레스 desmosomal 유전자의 endomyocardial 생 검에서 격리 하 고 따라서 그들의 변이 의해 영향을 받을 수 있습니다. 특히, 조건 하에서 adipogenic, ACM C-MSC 제어 마음에서 그 보다 더 많은 지질 축적. 이 증거 C MSC와 질병 병 인에 있는 활동적인 역할 ACM 공부를 유효한 셀 모델을 나타내는 결론에 이르게.
이런이 맥락에서 또는 다른 심장 질환 심장 생은 표시에서 미래 연구를 촉진 하기 위하여 상세한 프로토콜 endomyocardial 조직, 그들의 확장, 그들의 면역 phenotypical의 작은 파편에서 C-MSC의 격리에 대 한 제시 특성, 그리고 adipogenic 차별화입니다.
MSC와 C-MSC: MSC multipotent 셀 다른 성인 조직, 골 수, 지방 조직, 연골, 뇌, 피부, 태아 부속, 및 심장12등의 실질 부분에 있습니다. 다른 연구 분리 하 고 기본 및 변환 연구12,13의 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 특성 수행 되었습니다.
건강 한 조건에서 MSC는 무부하, 낮은 속도14에서 자체 갱신. 이후 그들은 환경 병 적인 변화에 노출 되는, 그들은 직접 transdifferentiation, 매트릭스 증 착, 또는 paracrine 효과14를 통해 육성 조직 리 모델링 반응.
심장 MSC (C-MSC) 심장4의 큰 비 myocyte 세포 인구를 나타냅니다. 그들은 epicardium에서 발생 하 고 상피-엽 전환15의 과정을 겪고 심근으로 마이그레이션할. 그들은 심장 구조, 생리와 cardiomyocytes와 세포 외 기질 항상성7,16상호 작용을 통해 병 적인 상태에서의 기계적 / 전기적 무결성에 기여할. 그러나, 광범위 한 범위의 C-MSC 기능은 아직도 완전히 이해 된다. 생리와 병 적인 조건에서 둘 다 생체 외에서 학문에 의해 촉진 될 수 그들의 역할의 더 깊은 지식을 그들의 격리 후 수행 합니다.
C-MSC는 인간의 마음, 심 방 부속 기2,17 등 우 심 실18의 다른 지구에서 얻은 되었습니다.
최근, C-MSC에서 인간의 오른쪽 심 실 endomyocardial bioptic 샘플을 되었습니다 가져올8, 소스 조직으로 3-5 밀리 그램으로 작은 것을 보여주는.
가능한 응용 프로그램: 이 원고에 설명 된 방법은 매우 작은 심장 표본에서 소화와 플라스틱 준수에 대 한 선택과 같은 몇 가지 간단한 구절에 포함 된 셀을 취득 수 있습니다.
C-MSC 이후 그들은 증폭 하 고 생체 외에서유지 하기 쉬운 엽 혈통 (endothelium, osteocytes, adipocytes)의 세포로 분화 할 수 셀 모델을 여겨질 수 있다. 또한, 환자에서 직접 셀을 얻기의 가능성 맞춤/정밀 의학의 맥락에서 기계 론 적인 연구에 대 한 훌륭한 체 외에 도구를 구성 합니다. 사실, 이러한 세포 유전 배경 및 기증자, 결국 특정 돌연변이 수행 하 고 임상 조건, 나이, 성별, 라이프 스타일, 그리고 약물 등 특정 환자의 특성에 의해 영향을 받습니다. 또한, 다른 표식에 대 한 정렬 가능성 특정 C-MSC 하위 집합19의 연구를 허용할 수 있습니다.
C-MSC는 다른 심혈 관 질환, 주로 심장의 개장 하는 불리 한 특징에서 활성 플레이어 알려져 있습니다. 따라서, 그들은 심장 질환8,20중화 소설 치료 전략에 대 한 후보 대상을 나타냅니다.
C-MSC 줄기 같은 속성 및 그들의 부족의 중요 한 immunogenicity 심장 재생 의학에 대 한 세포 치료에 그들의 잠재적인 응용 프로그램을 제안 합니다. 실제로, 골 수 또는 다른 소스에서 MSC, 같은 C-MSC 잠재적으로 사용할 수 헌와 기증자와 받는 사람21사이 일치를 위한 필요 없이 allogenic 설정에서.
또한, C-MSC, 직접 심장 조직에서에서 고립 되는 심장 마이크로-환경과 epigenetic 프로 파일에 의해 preconditioned 되 고의 이점이 있다. 심장 재생 의학의 맥락에서 특히 중요 한 성공적인 결과를 얻을 수 있습니다.
날짜 하려면, 재생 의학의 전 임상 연구 C-MSC 및 그들의 paracrine 활동18,,2223에 유용한 치료 가능성 확인. 중요 한 것은, 있는 셀 소스는 마음은 임상 시험 진행 cardiosfere 파생 셀 또는 C-MSC13,,2425의 부분 모집단 있습니다. 그러나, MSC 뼈 골 수 유래에 관해서는 다른 프로토콜 임상 등급 C-MSC26를 얻기 위해 필요한 수 있습니다.
C-MSC ACM에: 제시 프로토콜은 주로 endocardial 생 검 표시 된 병 리의 연구에 적합 하다. ACM 환자 진단 목적27bioptic 절차를 거칩니다. 그들의 심근 점차적으로 adipocytes과 섬유 증의 구성 전기 불활성 조직의 흉터 조직으로 대체 됩니다. 어디 진단 수율은 최대한, 흉터 영역에 bioptic 샘플링을 안내 하기 위해 endomyocardial 매핑 사용된10,,2829입니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 샘플 질병 심근의 테두리 영역에서 찍힌다.
Sommariva 외. 최근 ACM8, 때문에 그 마음에 preadipocytes는 엽 근원의 이다 C-MSC는 ACM 심장 지질에 적극적인 선수 시연의 병 인에서 C-MSC의 중추적인 역할을 정의 했습니다. 또한, C-MSC 격리 컨트롤 보다 지질 축적과 지질 둘 다 더 많은 경향을 보여 ACM 환자의 생 검에서 현재 프로토콜. 이러한 이유로,이 세포 일부 기계 연구9셀 모델의 적합성을 증명 하는 ACM의 분자 메커니즘을 확인 사용 수 있습니다.
제한 및 중요 한 단계: 환자 (단락 “가능한 응용 프로그램” 참조)에서 직접 C-MSC의 장점에도 불구 하 고이 프로토콜은 다른 제한을 받게 됩니다.
우선, 심장 bioptic 절차는 침략을 자주 엄격 하 게 필요한 경우. 실제로, 심장 조직 샘플링 윤리적으로 그리고 기술적으로 문제 이다. 심장 생을 수행 하기 위한 이유 차별 진단, 심장 이식의 상태를 모니터링 하거나 심장 종양30의 존재를 확인 cardiomyopathies의 맥락에서 확실 한 진단 달성 될 수 있습니다. 따라서, 단지 환자는 endomyocardial 생 검 합의 문을31 으로 표시 됩니다 C-msc 연구 등록할 수 있습니다. 또한, 심장 bioptic 절차 수 있다 임상 합병증, 특히 cardiomyopathic 마음에. 따라서, electrophysiologist의 samplings은 항상 신중 하 고 bioptic 샘플 셀의 절연 저하, 매우 작은 수 있습니다. 미래 실험 콜라 농도 조정 또는 소화의 타이밍이이 문제를 해결할 수 있습니다.
C-MSC, 모든 기본 인간 세포로 모든 고기에 다른 과목 중 높은 가변성을 표시 합니다. 실제로, 다른 과목에서 셀 변수 환경 조절에 다른 유전자 뿐만 아니라 또한 복종 있습니다. 특히,이 실험에서 세포 격리, 성장, 및 adipogenic 분화에 높은 가변성 관찰 됩니다.
현재의 프로토콜의 중요 한 단계는 인정 해야 합니다. Bioptic 샘플 모 세관을 포함 하는 경우 그들은 C-MSC 문화를 오염 시킬 수 있습니다 및 FACS 분석 (CD31 양성)에 의해 명시 될 수 있다 내 피 세포의 병렬 분리를 피하기 위해 제거 되어야 합니다. 효율적인 adipogenic 차별화를, 세포 활성 성장 단계에 있어야 합니다. 합류의 정도 지질 축적에도 영향을 미칠 수 있습니다.
방법의 중요성: 중간 엽 기질 세포의 고립의 이전 방법에 관하여 이것이 처음으로 인간의 심 실 bioptic 샘플에서 직접 C-MSC 획득의 설명 자세히 제시 된다. 이 메서드는 ACM 환자 샘플의 처리에 대 한 제안, 하지만 잠재적으로 심장 생 검 표시 된 모든 환자에 적용 됩니다.
이 프로토콜은 종종 수집 하기 어려운 더 큰 심장 샘플32필요한 셀의 획득에 대 한 이전 방법의 유용한 구현을 나타냅니다.
또한, 샘플 소스 흥미로운 혁신을 구성합니다. 심 실 생 심장33에 일반적으로 수행 하는 동안이 프로토콜 오른쪽 심 실 무료 벽에서 가져온 계정 샘플에 걸립니다. 병 오른쪽 심 실 지역에서 파생 된 셀 버스와 관련 된 질병의 pathologic 상태의 대표 될 수 있습니다.
또한, 현재 프로토콜에 사용 된 시 약의 일부는 다른 C-MSC 격리와 차별화 방법32에 관하여 다른. 예를 들어 콜라가이 원고에 제안 된 형식이 혼합 클래스 I 및 클래스 II collagenases 분해 활동의 균형 비율. 또한, 소화 솔루션 같은 기저 매체 (IMDM) C-MSC 문화 매체, 고립 된 C-MSC 미래 성장 조건에 적응할 수 있도록 준비에 대 한 사용에 녹아 콜라 혼합 구성 되어 있습니다.
또한, 비록 전체 C-MSC 인구를 사용 하 여 셀 배치를 표준화 수 정렬 절차만 이러한 셀의 플라스틱 준수 속성을 통해 고립, 단순화는 immunophenotypic를 변경 하지 않고 구성 C-MSC의 특성입니다. T. ADIPO이이 원고에 제안 된 구성 adipogenic 차별화, 피하 인슐린 같은 다른 구성 요소에 의해 유도 된 변화 dysregulation 이어질 수 있다.
오로 색도계 강도 평가에 근거 하는 지질 축적 정량화의 제안된 방법 방법 백분율을 기준으로 비교 하는 경우 누적된 지질의 수량에 대 한 더 많은 정보를 제공 하는 또한, 오로 얼룩 긍정적인 세포. 종종 지질 축적에 오로 추출 하 여 계량 소 프로 파 놀과 그 흡 광도 측정 셀으로. 그러나,이 메서드는 더 많은 구절을 필요로 하며 가변성 소 프로 파 놀 증발 때문에 복종 된다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품의 건강, 검색 전류 센트 Cardiologico Monzino-IRCCS에 이탈리아 정부에 의해 투자 되었다.
IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
ImageJ (image processing program) | NIH | ||
Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |