I denne artikkelen gis en metode for å isolere cardiac mesenchymal stromal celler fra endomyocardial bioptic prøver av arrhythmogenic kardiomyopati pasienter. Deres karakterisering og protokollen for å øke deres adipogenic differensiering er beskrevet.
Et vanlig voksen hjerte består av flere ulike celletyper, hvorav cardiac mesenchymal stromal cellene representerer en rikelig befolkning. Isolasjon av disse cellene tilbyr muligheten til å studere deres engasjement i hjerte sykdommer, og i tillegg gir en nyttig primære celle modell for å undersøke biologiske mekanismer.
Her beskrives metoden for isolering av C-MSC fra arrhythmogenic kardiomyopati pasienter bioptic prøver. Endomyocardial biopsi prøvetaking styres i høyre ventrikkel områdene ved siden arret visualisert ved electro-anatomiske kartlegging. Fordøyelsen av biopsier collagenase og deres plating på en plast rett i kultur medium slik at C-MSC veksten er beskrevet. Isolert cellene kan utvides i kultur for flere passasjer. For å bekrefte deres mesenchymal fenotype, tilbys beskrivelsen av immuno-phenotypical karakterisering. C-MSC er kjøpedyktig skille ut flere celletyper som adipocytter, chondrocytes og osteoblasts: i forbindelse med ACM, preget av adipocyte innskudd i pasientenes hjerter, protokollene for adipogenic differensiering av C-MSC og karakteristikk av lipid slippverktøy akkumulering er beskrevet.
Mesenchymal Stromal celler (MSC) er en viktig støttende funksjon i mange vev1voksen celler. Benmarg representerer MSC historiske kilden, men de kan være isolert fra ulike vev inkludert morkaken, fettvev, ledningen blod, lever og hjerte1,2.
I 2006 spesifisert International Society for mobilnettet terapi (ISCT) for første gang, minimal kriteriene som definerer menneskelige MSC3. Spesielt må MSC ha muligheten til å overholde plast. De uttrykke bestemt overflaten antigener: positivitet for CD44, CD105, CD29 og CD90 mesenchymal markører og negativitet for CD14, CD45, CD34, CD31 blodkreft og endothelial markører karakterisere MSC. På grunn av manglende uttrykk for HLA-DR, MSC er ikke utløse alloreactivity. Dessuten, de er multipotent celler til å skille mot adipogenic, chondrocyte og osteoblast linjene1,3.
Fokusere på cardiac mobilnettet komposisjon, er hjerte mesenchymal stromal celler (C-MSC) rikelig i en normal voksen hjertet4,5. De spiller en avgjørende rolle både i normal hjertefunksjon og patologiske forhold. Stund, fysiologisk C-MSC gir en microenvironment som støtter strukturelle og funksjonelle integriteten i myokard, i hjertesykdommer de aktiveres svar på hjertet skader deltar i sårheling og fibrotiske remodeling6 ,7.
Involvering av C-MSC i arrhythmogenic kardiomyopati (ACM) adipose erstatning har nylig vært demonstrert8. Spesielt er ACM en genetisk lidelse hovedsakelig forårsaket av mutasjoner i desmosomal gener som fører til hjerteinfarkt fibro fatty erstatning, hovedsakelig i høyre ventrikkel9. Denne erstatningen, strekker seg fra epicardium til endocardium, oppretter et ikke-ledende substrat som utløser progressiv hjertesvikt og forverres ventrikulær arytmi, som kan føre, i alvorlige tilfeller, plutselig død. Sommariva et al. vist mesenchymal opprinnelsen til før adipocytter i ACM pasienter explanted hjertet deler. Videre C-MSC isolert fra endomyocardial biopsies av ACM hjerter express desmosomal gener og dermed kan påvirkes av deres mutasjoner. Særlig under adipogenic forhold, ACM C-MSC samle mer lipider enn de fra kontroll hjerter. Dette bevis fører til konklusjonen at C-MSC både har en aktiv rolle i patogenesen sykdom og representerer en gyldig celle modell å studere ACM.
For å lette fremtidig forskning i denne sammenheng eller andre hjertesykdommer som en cardiac biopsi er angitt, vises en detaljert protokoll for isolering av C-MSC fra små fragmenter av endomyocardial vev, deres ekspansjon, deres immuno-phenotypical karakterisering og adipogenic differensiering.
MSC og C-MSC: MSC er multipotent celler bosatt i stromal brøkdel av forskjellige voksen vev, som benmargen, fettvev, brusk, hjernen, hud, fosterets vedlegg og hjertet12. Forskjellige studier er utført for å isolere og karakteriserer dem for potensielle programmer i grunnleggende og translasjonsforskning12,13.
Sunt forhold, MSC er quiescent, selv fornyende lave14. Siden de er utsatt for miljømessig patologiske forandringer, reagerer de fremme vev remodeling gjennom direkte transdifferentiation, matrise deponering eller paracrine effekt14.
Cardiac MSC (C-MSC) representerer en stor ikke-myocyte celle befolkningen av hjertet4. De kommer fra epicardium og overføre til myokard gjennomgår prosessen epithelial til mesenchymal overgang15. Bidrar til mekaniske og elektriske integriteten av cardiac strukturen, både fysiologiske og patologiske tilstander, gjennom interaksjoner med cardiomyocytes og ekstracellulær matrix homeostase7,16. Bredt utvalg av C-MSC funksjonene er imidlertid fortsatt ikke helt forstått. En dypere kunnskap om deres rolle i fysiologiske og patologiske forhold kan bli lettere i vitro studier utført etter deres isolasjon.
C-MSC har vært innhentet fra forskjellige distrikter i menneskets hjerte, som atrial appendage2,17 og høyre ventrikkel18.
Nylig har C-MSC fra menneskelige høyre ventrikkel endomyocardial bioptic prøver er innhentet av8, demonstrere at kilde-vev kan være så lite som 3-5 mg.
Mulig programmer: Metoden skissert i dette manuskriptet kan få celler med noen enkle passasjer, for eksempel fordøyelsen og utvalg for plast etterlevelse, fra svært lite hjerte prøver.
C-MSC kan betraktes som en celle modell, siden de er enkle å forsterke og opprettholde i vitro, og er i stand til å skille ut celler av mesenchymal avstamning (endotelet, osteocytes og adipocytter). Dessuten, muligheten for å skaffe cellene direkte fra pasienter utgjør et flott i vitro verktøy for mekanistisk studier i sammenheng med personlig/presisjon medisin. Faktisk disse cellene bære genetisk bakgrunn og til slutt bestemte mutasjoner av givere, og påvirkes av bestemte pasientenes egenskaper, for eksempel klinisk betingelser, alder, kjønn, livsstil og medisiner. Muligheten for sortering dem for ulike markører kan videre studier av bestemte C-MSC delsett19.
C-MSC er kjent for å være aktive spillere i ulike hjerte-karsykdommer, hovedsakelig preget av negative ombygging av hjertet. Derfor representerer de kandidat mål for romanen strategier mot hjertesykdommer8,20.
C-MSC stilk-lignende egenskaper og deres mangel på betydelig immunogenisitet foreslår deres potensielle anvendelse i cellen terapi for cardiac regenerativ medisin. Faktisk, som MSC fra benmarg eller andre kilder, C-MSC kan potensielt brukes både i autologous og allogenic innstillinger, uten behov for giver og mottaker21.
Tillegg har C-MSC, blir isolert direkte fra hjerte vev, fordelen av å være preconditioned av cardiac mikro-miljø og epigenetic profil. I forbindelse med hjerte regenerativ medisin, kan dette være spesielt viktig å få vellykkede resultater.
Hittil identifisert prekliniske studier av regenerativ medisin nyttig terapeutiske potensialet i C-MSC og deres paracrine aktivitet18,22,23. Viktigere, er kliniske studier som er cellen hjertet i gang med cardiosfere-avledet celler eller med subpopulasjoner av C-MSC13,24,25. Men som for bein margtransplantasjon-avledet MSC, kan forskjellige protokoller være nødvendig å få kliniske klasse C-MSC26.
C-MSC i ACM: Presentert protokollen er mest egnet for studiet av patologi som en endocardial biopsi er angitt. ACM pasienter gjennomgår bioptic prosedyrer for diagnoseformål27. Deres myokard er gradvis erstattet av arrvev, en elektrisk inert vev består av adipocytter og fibrose. For å lede bioptic prøvetaking arr området, der diagnostiske avkastningen er maksimal, er endomyocardial kartlegging brukt10,28,29. Eksemplene i denne protokollen er tatt sonen av syke myokard.
Sommariva et al. har nylig definert en sentral rolle i C-MSC i patogenesen av ACM8viser at C-MSC er aktive spillere i ACM hjertet adipogenesis, ettersom preadipocytes i de hjertene er mesenchymal opprinnelsesland. Tillegg isolert C-MSC med nåværende protokollen fra ACM pasienter biopsier viste flere tilbøyelighet til både lipid akkumulering og adipogenesis enn kontroller. Derfor kan disse cellene brukes til å bekrefte noen av molekylære mekanismer ACM, bevise deres egnethet som celle modell for mekanistisk studier9.
Begrensninger og avgjørende skritt: Til tross for fordelene ved å få C-MSC direkte fra pasienter (se avsnittet “Mulig programmer”), er denne protokollen utsatt for ulike begrensninger.
Først av alt kardial bioptic prosedyren er invasiv og ofte unngås hvis ikke strengt nødvendig. Faktisk er prøvetaking hjerte vev både etisk og teknisk problematisk. Grunner for å utføre en cardiac biopsi hende oppnåelse av en bestemt diagnose i sammenheng med cardiomyopathies differensialdiagnose, overvåking av statusen til hjerte transplantasjoner eller konstatere tilstedeværelsen av en hjertet svulst30. Derfor kan bare pasienter som en endomyocardial biopsi angis av konsensus uttalelse31 være registrert for forskning på C-MSC. Videre kan cardiac bioptic prosedyren har klinisk komplikasjoner, fremfor alt i cardiomyopathic hjerter. Derfor electrophysiologist’s prøvetaking er alltid forsiktig og bioptic eksempler kan være veldig små, at isolering av celler. Senere eksperimenter kunne overvinne problemet av tuning collagenase konsentrasjon eller tidspunktet for fordøyelsen.
C-MSC, viser som alle primære menneskelige celler, en høy variasjon blant ulike fag i alle fenotyper. Celler fra ulike fag er faktisk ikke bare genetisk forskjellig, men også utsatt til variabel miljømessige condition. Spesielt i dette eksperimentet, er en høy variasjon i celle isolasjon, vekst og adipogenic differensiering observert.
Avgjørende skritt av nåværende protokollen har å bli anerkjent. Hvis bioptic prøven inkluderer kapillærene, må de fjernes for å unngå parallelle isolering av endotelceller, som kan forurense C-MSC kulturen, og kan bevitnes av FACS analyse (positivitet for CD31). For å få en effektiv adipogenic differensiering, må cellene ligge i en aktiv vekstfase. Graden av samløpet kan også påvirke lipid akkumulering.
Betydningen av metoden: Forhold til forrige metoder for isolering av mesenchymal stromal celler er dette første gang der beskrivelsen av C-MSC obtainment direkte fra menneskelige ventrikkel bioptic prøver foreslås i detalj. Selv om denne metoden er foreslått for behandling av ACM pasientprøvene, er det potensielt gjelder alle pasientene som en cardiac biopsi er angitt.
Denne protokollen representerer en nyttig implementering av metodene for obtainment av celler som krevde større hjerte prøver32, som er ofte vanskelig å samle.
Videre utgjør prøvekilden en interessant nyhet. Mens den ventrikkel biopsi er vanligvis utført på septum33, tar denne protokollen konto prøver innhentet fra høyre ventrikkel gratis veggen. Cellene stammer fra syke høyre ventrikkel district kan være mer representativt for patologisk status for sykdommer som involverer RV.
I tillegg er noen av reagensene i stede protokollen forskjellige forhold til andre C-MSC isolasjon og differensiering metoder32. For eksempel collagenase foreslått i dette manuskriptet er en blanding av klasse I og klasse II collagenases med et balansert forhold av proteolytisk aktiviteter. Videre består fordøyelsen løsningen av collagenase mix oppløst i samme basale medium (IMDM) brukes for utarbeidelse av C-MSC kultur medium, tillater isolert C-MSC å tilpasse fremtidig vekst forhold.
I tillegg om sortering prosedyrer kan standardisere celle bunke med hele C-MSC befolkningen, isolert gjennom egenskapen plast etterlevelse av disse cellene, utgjør en forenkling uten å endre immunophenotypic kjennetegner C-MSC. Sammensetningen av T. ADIPO foreslått i dette manuskriptet er kunne føre til adipogenic differensiering, unngå metabolske feilregulering indusert av andre komponenter som insulin.
Videre gir den foreslåtte metoden av lipid akkumulering kvantifisering, som er basert på vurderingen av ORO kolorimetrisk intensiteten, mer informasjon om antall akkumulerte lipider, hvis sammenlignet med metoder basert på prosent celler som er positive til den ORO flekker. Ofte lipid akkumulering er kvantifisert ved utpakking ORO innlemmet ved celler med isopropanol og måle sin absorbance. Men denne metoden krever mer passasjer og er utsatt for variasjon på grunn av isopropanol fordampning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av italiensk Helsedepartementet, Ricerca Corrente til Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.
IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
ImageJ (image processing program) | NIH | ||
Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |