I denna artikel föreskrivs en metod för att isolera hjärt mesenkymala stromaceller från endomyokardiella bioptic prover av Högerkammarfunktion kardiomyopati patienter. Deras karakterisering och protokollet till öka deras adipogena differentiering beskrivs.
En normal vuxen hjärtat består av flera olika celltyper, bland vilka hjärt mesenkymala stromaceller representerar en riklig befolkning. Isolering av dessa celler erbjuder möjligheten att studera deras deltagande i hjärtsjukdomar, och dessutom ger en användbar primär cell modell för att undersöka biologiska mekanismer.
Här beskrivs metoden för isolering av C-MSC från Högerkammarfunktion kardiomyopati patienternas bioptic prover. Endomyokardiella biopsi provtagningen styrs i områdena höger kammare intill ärret visualiseras av electro-anatomisk kartläggning. Nedbrytning av biopsier i kollagenas och deras plätering på en plast skålen i odlingsmedium för att C-MSC tillväxt beskrivs. De isolerade cellerna kan utökas i kulturen för flera passager. För att bekräfta deras mesenkymala fenotyp, tillhandahålls beskrivningen av immuno-fenotypiska karakteriseringen. C-MSC är kunna differentieras till flera celltyper som adipocyter, kondrocyter och osteoblaster: i samband med ACM, kännetecknas av fettceller insättningar i patienters hjärtan, protokollen för adipogena differentiering av C-MSC och karakterisering av lipid droplet ackumulering beskrivs.
Mesenkymala stromaceller celler (MSC) är vuxna celler med en viktig stödjande funktion i många vävnader1. Benmärgen utgör historiska källan till MSC, men de kan isoleras från olika vävnader inklusive placenta, fettvävnad, navelsträngsblod, levern och hjärtat1,2.
I 2006 anges den internationella föreningen för cellulära terapi (ISCT), för första gången, minimal kriterier för att definiera mänskliga MSC3. I synnerhet måste MSC ha möjlighet att ansluta sig till plast. De uttrycker specifika ytantigener: positivitet för CD44, CD105, CD29 och CD90 mesenkymala markörer, och negativitet för CD14, CD45, CD34, CD31 hematopoetiska och endotelceller markörer karakterisera MSC. På grund av brist på uttrycket av HLA-DR, MSC är oförmögna att utlösa alloreaktivitet. Dessutom är de multipotenta celler med potential att differentiera mot adipogena, chondrocyte och osteoblast härstamningar1,3.
Fokusera på hjärt cellulära sammansättningen, är hjärt mesenkymala stromaceller (C-MSC) rikligt i en normal vuxen hjärtat4,5. De spelar en avgörande roll både i normal hjärtfunktion och sjukliga tillstånd. Tag, fysiologiskt, C-MSC ger en närmiljön som stödjer hjärtmuskeln strukturella och funktionella integritet, i hjärtsjukdomar de aktiveras som svar på hjärt-skada som deltar i sårläkning och fibrotiska remodeling6 ,7.
Nyligen har C-MSC engagemang i Högerkammarfunktion kardiomyopati (ACM) fett substitution varit visat8. I synnerhet är ACM en genetisk sjukdom som främst orsakas av mutationer i desmosomal gener som leder till hjärtinfarkt fibro-fettsyror replacement, främst i höger kammare9. Denna substitution, sträcker sig från epicardium till endocardium, skapar ett icke-ledande substrat som framkallar progressiv hjärtsvikt och förvärrar ventrikulära arytmier, vilket kan leda, i svåra fall, till plötslig död. Sommariva o.a. visade de före adipocyter mesenkymala ursprung i ACM patienternas explanterad hjärtat sektioner. Dessutom C-MSC isolerade från endomyokardiella biopsier av ACM hjärtan express desmosomal gener och därför kan påverkas av deras mutationer. I synnerhet under adipogena förhållanden, ACM C-MSC ackumulera mer lipider än de från kontroll hjärtan. Detta bevis leder till slutsatsen att C-MSC både har en aktiv roll i sjukdomen patogenesen och representerar en giltig cell modell att studera ACM.
För att underlätta framtida forskning i detta sammanhang eller andra hjärtsjukdomar som en hjärt biopsi indikeras, presenteras ett detaljerat protokoll för isolering av C-MSC från små fragment av endomyokardiella vävnad, deras expansion, deras immuno-fenotypiska karakterisering och adipogena differentiering.
MSC och C-MSC: MSC är multipotenta celler bosatt i stromaceller fraktionen av olika vuxna vävnader, såsom benmärg, fettvävnad, brosk, hjärna, hud, fostrets bilagorna och hjärtat12. Olika studier har utförts för att isolera och karakterisera dem för potentiella tillämpningar i grundläggande och translationell forskning12,13.
I sunda förhållanden är MSC quiescent, själv förnya lågt14. Eftersom de utsätts för patologiska förändringar i miljön, reagerar de främja vävnad remodeling genom antingen direkt transdifferentiation, matrix nedfall eller parakrin effekt14.
Hjärt MSC (C-MSC) representerar en stor icke-myocyt cell befolkningen av hjärtat4. De härstammar från epicardium och migrera till hjärtmuskeln som genomgår processen för epitelial-till-mesenkymala övergången15. De bidrar till hjärt struktur, både i fysiologiska och patologiska stater, genom interaktioner med hjärtmuskelceller och extracellulär matrix homeostas7,16mekaniska och elektriska integritet. Men funktionerna breda utbud av C-MSC är fortfarande inte helt förstått. En djupare kunskap om deras roll som både fysiologiska och patologiska förhållanden kan underlättas genom in vitro- studier utförs efter deras isolering.
C-MSC har erhållits från olika distrikt i det mänskliga hjärtat, såsom förmak bihang2,17 och höger kammare18.
Nyligen, C-MSC från mänskliga höger kammare endomyokardiella bioptic prover har erhållits8, visar att källa vävnaden kunde vara så lite som 3-5 mg.
Möjliga tillämpningar: Den metod som anges i detta manuskript kan få celler med några enkla stycken, såsom matsmältning och urval för plast följsamhet, från mycket små hjärtat exemplar.
C-MSC kan betraktas som en cell modell, eftersom de är lätta att förstärka och underhålla i vitro, och kan skilja i celler av mesenkymala härstamning (endotel, osteocyter och adipocyter). Dessutom utgör möjligheten att erhålla celler direkt från patienter en stor in vitro- verktyg för mekanistiska studier i samband med personlig/precision medicin. Faktiskt, dessa celler bär den genetiska bakgrunden och så småningom specifika mutationer av givarna, och påverkas av särskilda patienternas kännetecken, såsom kliniska tillstånd, ålder, kön, livsstil och mediciner. Dessutom kan möjligheten att sortera dem för olika markörer studiet av specifika C-MSC delmängder19.
C-MSC är kända för att vara aktiva spelare i olika hjärt-kärlsjukdomar, främst kännetecknas av negativa omdaning av hjärtat. De representerar därför kandidat mål för nya terapeutiska strategier för att motverka hjärtsjukdomar8,20.
C-MSC stem-liknande egenskaper och deras brist på betydande immunogenicitet antyder deras potentiella tillämpning i cell-terapi för hjärt regenerativ medicin. Verkligen, som MSC från benmärg eller andra källor, C-MSC kan potentiellt användas såväl i autologa prövningar inställningar, utan behov för matchning mellan givare och mottagare21.
C-MSC, isoleras direkt från hjärtat vävnad, har dessutom fördelen av att vara kopp av hjärt mikro-miljö- och epigenetiska profil. I samband med hjärt regenerativ medicin, kan detta vara särskilt viktigt att få lyckade resultat.
Hittills har identifierat prekliniska studier av regenerativ medicin användbar terapeutisk potential i C-MSC och deras parakrin aktivitet18,22,23. Ännu viktigare, pågår kliniska prövningar där cellen källan är hjärtat med cardiosfere-derived celler eller med subpopulations av C-MSC13,24,25. När det gäller ben-märg-härledda MSC, kan olika protokoll dock krävs för att uppnå klinisk grade C-MSC26.
C-MSC i ACM: Presenterade protokollet är mest lämplig för studier av patologier som en endokardiella biopsi indikeras. ACM patienter genomgå bioptic förfaranden för diagnostiska ändamål27. Deras hjärtmuskeln ersätts gradvis av ärr-vävnad, en elektriskt inert vävnad som består av adipocyter och fibros. För att vägleda bioptic provtagning till ärr-området, där det diagnostiska utbytet är maximal, är endomyokardiella mappning begagnade10,28,29. De prover som används i detta protokoll tas i gränsområdet sjuka hjärtmuskeln.
Sommariva et al. har nyligen definierat en nyckelroll för C-MSC i patogenesen av ACM8, visar att C-MSC är aktiva spelare i ACM hjärtat adipogenesis, eftersom Preadipocyter i dessa hjärtan av mesenkymala ursprung. Dessutom isolerade C-MSC med detta protokoll från ACM patienternas biopsier visade mer benägenhet att både lipid ackumulering och adipogenesis än kontroller. Därför kan dessa celler användas för att bekräfta några av de molekylära mekanismerna av ACM, bevisar deras lämplighet som cell modell för mekanistiska studier9.
Begränsningar och kritiska steg: Trots fördelarna för att få C-MSC direkt från patienter (se stycket ”möjliga tillämpningar”), utsätts detta protokoll för olika begränsningar.
Först och främst hjärt bioptic förfarandet är invasiv och ofta undvikas om inte absolut nödvändigt. Provtagning hjärtvävnad faktiskt såväl tekniskt som etiskt problematiskt. Skälen för att utföra en hjärt biopsi kan vara att uppnå en definitiv diagnos i samband med kardiomyopati i differentiell diagnos, övervakning av statusen för hjärt transplantationer eller att fastställa förekomsten av en hjärta tumör30. Därför kan endast patienter som en endomyokardiella biopsi indikeras av samförstånd uttalande31 registreras för forskning om C-MSC. Dessutom kan hjärt bioptic förfarandet ha kliniska komplikationer, framför allt i cardiomyopathic hjärtan. Därför electrophysiologist’s provtagningar är alltid försiktig och bioptic prover kan vara mycket liten, att kompromissa med isolering av celler. Framtida experiment kunde övervinna problemet genom tuning kollagenas koncentration eller tidpunkten för matsmältningen.
C-MSC, Visa som alla primära mänskliga celler, en hög variabilitet mellan olika ämnen i alla fenotyper. Celler från olika ämnen är faktiskt inte bara genetiskt olika, men också betvingade till variabel miljö luftkonditionering. Specifikt inom detta experiment observeras en hög variation i isolering, tillväxt och adipogena celldifferentiering.
Kritiska steg i detta protokoll måste erkännas. Om bioptic provet innehåller kapillärer, måste de tas bort för att undvika parallella isolering av endotelceller, som kan förorena C-MSC kulturen, och som kan styrkas av den FACS analysen (positivitet för CD31). För att få en effektiv adipogena differentiering, måste celler i en aktiv tillväxtfas. Graden av sammanflödet kan också påverka lipid ackumulering.
Betydelse för metoden: Med avseende på tidigare metoder för isolering av mesenkymala stromaceller är detta första gången där beskrivningen av C-MSC obtainmenten direkt från mänskliga ventrikulära bioptic prover föreslås i detalj. Även om denna metod föreslås för bearbetning av ACM patientprover, är det potentiellt tillämpliga på alla patienter som en hjärt biopsi indikeras.
Detta protokoll utgör en användbar genomförandet av föregående metoder för obtainmenten av celler som krävs större hjärt prover32, som ofta är svåra att samla in.
Dessutom utgör provkällan en intressant innovation. Medan ventrikulära biopsi utförs vanligtvis på de septum33, tar detta protokoll in i konto produktproverna höger kammare gratis väggen. Celler från distriktet sjuka höger kammare kan vara mer representativ för patologiska status för sjukdomar som involverar RV.
Dessutom är några av de reagens som används i detta protokoll olika med avseende på andra C-MSC isolering och differentiering metoder32. Till exempel vilken typ av kollagenas som föreslås i detta manuskript är en blandning av klass I och klass II kollagenaserna med ett balanserat förhållande av proteolytiska verksamhet. Dessutom består matsmältningen lösningen av kollagenas blandning upplöst i samma basala medium (IMDM) används för beredning av C-MSC odlingsmedium, så att isolerade C-MSC att anpassa sig till framtida tillväxt.
Dessutom även sortering förfaranden skulle kunna standardisera cell batchen, använder hela C-MSC befolkningen, isolerade endast via egenskapen plast följsamhet i dessa celler, utgör en förenkling utan att ändra immunophenotypic Kännetecken för C-MSC. Sammansättningen av T. ADIPO föreslås i detta manuskript är kompetent att leda till adipogena differentiering, undvika den metabola dysreglering inducerad av andra komponenter såsom insulin.
Dessutom ger den föreslagna metoden för lipid ackumulering kvantifiering, som är baserat på utvärdering av ORO kolorimetriska intensitet, mer information om kvantiteten av de ackumulerade lipider, om jämfört med metoder baseras endast på andelen av celler som är positiva till ORO färgningen. Ofta lipid ackumulering kvantifieras genom att extrahera ORO införlivas genom celler med isopropanol och mätning av dess absorbering. Men denna metod kräver fler passager och utsätts för variabilitet på grund av isopropanol avdunstning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av italienska hälsovårdsministeriet, Ricerca Corrente till Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.
IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
ImageJ (image processing program) | NIH | ||
Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |