جراحة ستيريوتاكسيك للتلاعب بالجينات في خلايا أدمغة الفأر الولدان سترياتال
Summary
يصف لنا على بروتوكول لجراحة ستيريوتاكسيك مع جهاز ثابت رئيس محلية صنع الكاشفات ميكروينجيكتينج في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة. هذا الأسلوب يتيح التلاعب بالجينات في الخلايا العصبية في مناطق معينة من أدمغة الفأر حديثي الولادة.
Abstract
يتم التعبير عن العديد من الجينات في أدمغة الأجنة، وبعضهم يعبر عن استمرار في الدماغ بعد الولادة. لهذه الجينات، وأعرب عن إصرار أنها قد تعمل لتنظيم عملية التنمية و/أو الوظيفة الفسيولوجية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة. للتحقيق في الوظائف العصبية الحيوية من جينات محددة في الدماغ، من الضروري إلغاء تنشيط الجينات في الدماغ. هنا، نحن تصف طريقة ستيريوتاكسيك بسيطة لإلغاء تنشيط التعبير الجيني في المخطط الفئران المحورة وراثيا في إطارات زمنية الولدان. كانت ميكروينجيكتيد الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في المخطط Ai14 مراسل جينات الفئران في يوم بعد الولادة (ف) 2 بجراحه الدماغ ستيريوتاكسيك. تم الكشف عن الجينات مراسل تدتوماتو في المخطط P14، مما يوحي نجاح لجنة المساواة العرقية-لوكسب يتوسط جزئ الحمض النووي في الخلايا سترياتال ترانسدوسيد إف. كذلك نحن التحقق من صحة هذا الأسلوب من ميكروينجيكتينج الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في الفئران P2Foxp2fl/فلوريدا . وسم مزدوجة للتجارة والنقل و Foxp2 أظهرت أن الخلايا إيجابية بروتينات فلورية خضراء تفتقر إلى إيمونوريكتيفيتي Foxp2 في المخطط P9، مما يوحي بفقدان البروتين Foxp2 في لجنة المساواة العرقية اجفب إف ترانسدوسيد سترياتال الخلايا. مجتمعة، هذه النتائج تبرهن حذف وراثية فعالة بالفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية ستيريوتاكسيكالي ميكروينجيكتيد في فئات معينة من السكان الخلايا العصبية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة من الفئران المعدلة وراثيا فلوكسيد. وفي الختام، لدينا تقنية ستيريوتاكسيك يوفر منبرا سهلة وبسيطة للتلاعب بالجينات في أدمغة الفأر حديثي الولادة. هذا الأسلوب لا يمكن استخدامها فقط لحذف الجينات في مناطق معينة من أدمغة الأطفال حديثي الولادة، ولكن أيضا يمكن استخدامه لحقن العقاقير الدوائية، تتبع الخلايا العصبية، أوبتوجينيتيكس المعدلة وراثيا والبروتينات تشيموجينيتيكس، مؤشرات نشاط الخلايا العصبية و الكواشف الأخرى في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة.
Introduction
الدراسات الحديثة لهيكل ووظيفة المخ عادة ما تتطلب التحوير الوراثي لجينات معينة في الخلايا العصبية. وقد تم إنشاؤها للتحقيق في وظائف جينات مختلفة، الفئران المحورة وراثيا تحمل الآليلات متحولة، بما في ذلك بشكل روتيني خروج المغلوب والمغلوب في الآليلات. جراحة المخ ستيريوتاكسيك للقوارض الكبار أسلوب قياسي لتسليم المخدرات وتتبع وفيروسات أخرى الكواشف محلياً إلى مناطق معينة من أدمغة القوارض1،2. تطبيق جراحة الدماغ ستيريوتاكسيك على الفئران المحورة وراثيا يسمح أحد للتلاعب وراثيا بوظيفة الجينات ونشاط الخلايا العصبية في فئات معينة من السكان الخلايا العصبية في الدماغ الماوس. التلاعب الخلية بنوع خاص يوفر نهج قوية فك الوظائف العصبية في مجمع الدوائر العصبية من المخ3،،من45.
تبدأ التنمية العصبية للجهاز العصبي في المراحل الجنينية المبكرة، والعمليات الإنمائية التي تستمر بعد الولادة حتى فترة الأحداث. ويشمل نضج الجهاز العصبي بعد الولادة الأسلاك متشابك دقيقة من الدوائر العصبية، هو أمر ضروري للوظائف الفسيولوجية والإدراكية ل الدماغ6. ولذلك، دراسة الأحداث التنموية التي تحدث في windows وقت حديثي الولادة مهم ليس فقط لفهم التنمية العصبية الطبيعية، ولكن كما يجوز تقديم رؤى في الآلية المرضية للنماء العصبي والاضطرابات العصبية7 ،8. على الرغم من أن أساليب جراحة المخ ستيريوتاكسيك للقوارض الكبار متاحة2،9، البروتوكولات القليلة المتاحة على شبكة الإنترنت لعملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك في الفئران حديثي الولادة10،11. في الواقع، ميكروينجيكشنز ستيريوتاكسيك من الكواشف في أدمغة الفأر المواليد الجراء صعبة، لأن رأس ألجرو الولدان هشة جداً لتكون ثابتة في الجهاز ستيريوتاكسيك القياسية. على الرغم من ذلك، يتم تطبيق عملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك على الفئران المعدلة وراثيا ممكنة للفئران حديثي الولادة12. وهنا يصف لنا طريقة بسيطة مع إعداد محلية صنع لإجراء عملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك في الجراء الماوس حديثي الولادة. علينا أن نظهر أن هذا الأسلوب يسمح أحد لحذف الجينات فلوكسيد مشروط ميكروينجيكتينج ريكومبيناسي إف-الإعراب عن “الحمض النووي لجنة المساواة العرقية” في المخطط لمراسل جينات الفئران والفئران المعدلة وراثيا فلوكسيد إفراجاً مشروطاً. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على تسليم المواد الكاشفة في المخطط الولدان من الفئران البرية من نوع.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الدراسة الحالية، ونظهر أسلوب ستيريوتاكسيك بسيطة وموثوق بها لحقن الفيروسات إف في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة. ونحن ميكروينجيكتيد الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في المخطط Ai14 مراسل الفئران في P2 وثم تحليل تعبير الجينات مراسل في P14. ووجدنا إف ترانسدوسيد الخلايا الح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا تمنح MOST104-2311-B-010-010-MY3، MOST106-2321-ب-010-012، ومعاهد البحوث الصحية الوطنية في منح المؤسسات الوطنية-EX106-10429NI، ومنحة “البرنامج مركز بحوث المناطق” الموصى بها من وزارة التربية من خلال مركز أبحاث الدماغ، جامعة يانغ مينغ الوطنية في تايوان، ، ومنح “زمالات ما بعد الدكتوراه” MOST106-2811-ب-010-031 (س-أ)، MOST105-2811-ب-010-036 و MOST106-2811-ب-010-030 (حاء-مجموعة).
Materials
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1K |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506×1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1×1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
References
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
