Stratégies d’échantillonnage et traitement des échantillons de tissu de la biobanque de modèles biomédicaux porcins

Summary

L’application pratique et les performances des méthodes pour la génération d’échantillons de tissus représentant des modèles animaux porcins pour un large éventail d’analyses en aval dans les projets de la biobanque sont démontrées, y compris la volumétrie, l’échantillonnage aléatoire systématique, et le traitement différencié des échantillons de tissus pour les types d’analyses qualitatives et quantitatives, morphologiques et moléculaires.

Abstract

Pour la recherche translationnelle, modèles porcines sont progressivement devenus plus populaires. Étant donné la valeur élevée de chaque animal, en particulier des porcs génétiquement modifiés, modèles et le nombre souvent limité d’animaux disponibles de ces modèles, création de collections (biobanque) des échantillons de tissu suffisamment transformés adapté pour un large spectre des méthodes d’analyses subséquentes, y compris les analyses non précisés à l’instant d’échantillonnage, représentent des approches utiles pour profiter pleinement de la valeur translationnelle du modèle. En ce qui concerne les particularités de l’espèce porcine anatomie, des lignes directrices exhaustives ont récemment été établies pour génération normalisée de représentant, échantillons de haute qualité provenant de différents organes porcins et tissus. Ces lignes directrices sont des conditions essentielles pour la reproductibilité des résultats et la comparaison entre différentes études et les enquêteurs. L’enregistrement des données de base, tels que le poids des organes et volumes, la détermination des sites d’échantillonnage et du nombre d’échantillons de tissus à générer, ainsi que leur orientation, taille, traitement et directions de coupe, est des facteurs pertinents détermination de la généralisation et la convivialité de l’échantillon pour des analyses morphologiques moléculaires, qualitatives et quantitatives. Ici, une démonstration illustrative, pratique, étape par étape des techniques plus importantes pour la production de représentant, biobanque multi-usages spécimen provenant de tissus porcins est présenté. Les méthodes décrites ici incluent la détermination de volumes d’organes et de tissus et de la densité, l’application d’une procédure d’échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume pour les organes parenchymateux par comptage point, détermination de l’étendue du retrait de tissu associés à enrobage histologique des échantillons et génération d’échantillons orientés au hasard pour des analyses quantitatives stéréologiques, comme isotrope uniforme aléatoire (IUR) sections générées par les méthodes « Orientation » et « Isector » et vertical uniforme sections (RVU) aléatoires.

Introduction

Dans la médecine translationnelle, les porcs sont plus en plus courants pour une utilisation comme modèles de grand animaux^1,2,3,4,5, en raison de nombreuses similitudes avantageux entre le porc et anatomie et physiologie et la disponibilité de méthodes biologiques moléculaires établies permettant la génération d’adapté, modifié génétiquement des modèles de porc pour un large éventail de maladies conditions^1,4.

Toutefois, par rapport aux modèles de rongeurs, le nombre d’animaux d’un modèle de cochon respectifs qui peuvent être fournis pour expériences en tout temps est limité. Cela est dû à l’intervalle de génération porcin d’environ un an et les efforts financiers et beaucoup de temps requis pour la génération de modèles de porcins et de l’élevage. Par conséquent, les animaux individuels d’un modèle porcin, ainsi que les échantillons qui peuvent être générés de ces porcs, sont très précieux, en particulier si génétiquement modifiée modèles porcines et/ou des problèmes expérimentaux à long terme (p. ex., complications tardives de maladies chroniques) sont examinées dans les individus âgés de^6,2,7.

Dans le cadre de toute étude, exécution d’analyses supplémentaires, qui ne était pas prévue dans le protocole expérimental de l’étude initial pourrait plus tard se pour révéler pertinentes, par exemple, à l’adresse des questions distinctes découlant précédemment découvert résultats inattendus. Si les échantillons appropriés pour de telles expériences supplémentaires ne sont pas disponibles, coût disproportionnellement plus élevé et les dépenses de beaucoup de temps peuvent être nécessaires de produire des porcs supplémentaires et des échantillons de tissus. Pour être préparé à ces éventualités, génération de biobanque collections d’échantillons de sauvegarde conservées des différents organes, de tissus ou liquides bio, quantitativement et qualitativement adaptées pour un large éventail d’analyses ultérieures, est considéré comme un important approche^2,6,7. Découlant des prestations optimales un modèle animal porcin, la disponibilité des échantillons adéquats biobanque offre également la possibilité unique pour effectuer un large éventail de méthodes d’analyse différentes sur les matériaux des échantillons identiques sur un niveau de plusieurs organes dans la même chaque animal, par exemple, par la distribution d’échantillons à des scientifiques de différents groupes de travail organisés en un réseau de recherche sur^2,6,7. En outre, la stratégie d’échantillonnage ” tourné vers l’avenir ” dans les biobanques contribue également à une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans une étude. Les avantages du modèle porcin biobanques ont récemment été démontrés dans un multi-organes, étude multiomics, orgue la diaphonie dans un modèle porcin génétiquement modifié du diabète à long terme, sur des échantillons de la biobanque de porc Munich MIDY ².

Il y a certaines exigences obligatoires biobanque échantillons doivent généralement respecter pour établir la fiabilité et la facilité d’interprétation des résultats des analyses effectuées par la suite. Les échantillons doivent être générés de façon reproductible, et ils doivent être représentatifs, c’est-à-diresuffisamment reflétant les caractéristiques morphologiques et moléculaires intéressées des tissus ou d’organes les échantillons ont été prélevés à⁷. Pour convenir à un large éventail de types d’analyses en aval, les échantillons doivent être pris en quantité suffisante et traitées selon les demandes (y compris les conditions de temps et température) différentes méthodes d’analyse, y compris les descriptifs analyses histopathologiques, tels que cryohistology, paraffine et plastique histologie, immunohistochimie, hybridation in situ , analyses microscopiques électron ultrastructurales et bilans diagnostiques de laboratoire clinique, aussi bien que moléculaires analyses d’ADN, d’ARN, de protéines et de métabolites.

Pour permettre l’évaluation d’un large éventail de distinctes paramètres morphologiques quantitatifs tels que des nombres, des volumes, longueurs ou des surfaces de structures tissulaires distinctes par des analyses quantitatives stéréologiques, section randomisée des avions de la des échantillons histologiques des tissus/organes respectifs doivent être préparés à^7,8,9,10,11. Dans des études morphologiques quantitatifs, la détermination précise du volume total des tissus, organes ou compartiment de l’orgue, les échantillons ont été prélevés de (c.-à-d., l’espace de référence) est d’une importance cruciale^{7,9 , 12} pour calculer les quantités absolues des paramètres au sein de l’organe respectif, des tissus ou organisme intéressés. Finalement, l’effet du retrait de tissu incorporation liées au cours de la préparation des coupes histologiques doit être déterminé et pris en compte¹³. Par conséquent, des analyses quantitatives stéréologiques, notamment des échantillons archivés (corrigé d’échantillons de tissus, tissus incorporé blocs, coupes histologiques, etc.) dans les études précédentes sont parfois¹²sévèrement limité, voire même impossible, surtout si la volumétrie des tissus/organes respectifs ne faisait pas, si aucun de ses designs d’échantillonnage adéquates ont été appliqués pour justifier des échantillons représentatifs, si les nombres et les quantités d’échantillons individuels disponibles ne suffisent pas, ou si le traitement de la échantillons est incompatible avec l’estimation du ou les paramètres morphologique quantitatif d’intérêt. En raison des multiples facteurs d’influence possibles, l’aptitude des matériaux archive-échantillon pour des analyses des paramètres morphologiques quantitatifs distincts impossible de répondre sans équivoque, mais dépend de l’évaluation minutieuse de chaque cas individuel.

Ainsi, comme l’emplacement, taille, nombre, traitement, direction de coupe et l’orientation des échantillons potentiellement affecte les résultats des analyses ultérieures, ces facteurs sont d’une grande importance et doivent être envisagées dans le protocole expérimental d’aucune étude. En ce qui concerne ces aspects et les particularités de l’anatomie porcin, directives d’échantillonnage complet, détaillé et à grande échelle des modèles animaux adaptés aux porcins ont récemment été créées, offrant une solide référence à standardisées et reproductibles et la production efficace de redondants, suffisamment transformés, qualité des échantillons de plus de 50 différents porcine organes et tissus^6,7.

Les descriptions méthodologiques et le didacticiel vidéo montré dans le présent article prévoient détaillées, exemples, compréhensible, instructions étape par étape pour une performance pratique d’une variété de techniques de volumétrie, prélèvement d’échantillons de tissus porcins et organes et traitement des échantillons de tissus pour analyse en aval différentes méthodes. Les techniques recommandés incluent des méthodes pour la détermination des volumes d’organes et de tissus et de densités fondées sur les principes d’Archimède et Cavalieri⁹, y compris la détermination des dimensions de rétrécissement en trois dimensions des tissus associés à la intégration dans différents encastrement médias¹⁴ pendant le traitement pour examen histologique, application d’échantillonnage aléatoire systématique possible pondérée en fonction du volume s’approche, traitement des échantillons de tissus prélevés pour différents ultérieures analyses^7,8,9,15et génération de convenablement orienté et traitement échantillons pour potentiel des analyses quantitatives stéréologique^{7,8, 9,10,11}. À côté de leur application dans des projets porcins biobanque, les méthodes démontrées sont généralement appropriées pour toutes les études examinant les propriétés histo-morphologiques quantitatifs des organes/tissus. En outre, conceptions de l’échantillonnage aléatoire systématique sont particulièrement bénéfiques pour la génération d’échantillons représentatifs dans les expériences à l’aide de méthodes d’analyse moléculaire pour détecter les altérations de l’abondance de, par exemple, ARN, protéines ou métabolites dans différents organes et tissus.

Les sections suivantes fournissent une brève introduction à ces méthodes, tandis que leur performance pratique est décrite dans la section protocole.

Détermination des volumes d’organes et de tissus
Détermination du poids des organes et des volumes est importante dans plusieurs paramètres expérimentaux, que ces facteurs pourraient indiquer des changements, potentiellement liées à expérimentalement examiné les facteurs d’intérêt. Le volume total d’un organe ou le tissu est aussi communément requis pour calculer les paramètres quantitatifs absolues, (par exemple, le nombre total de cellules), des densités de volume numérique stereologically estimé (c.-à-d., le nombre de cellules par unité de volume du tissu)^7,12. En dehors des techniques utilisant des équipements techniques complexes, comme la tomographie par ordinateur, il existe essentiellement trois méthodes pratiques habituellement utilisées pour déterminer le volume absolu d’un organe ou tissu. Le volume d’un organe peut être déterminé par « mesure volumétrique directe » selon le principe d’Archimède, c’est-à-dire, en mesurant le volume d’eau ou une solution saline déplacés par la structure lorsqu’il est complètement submergé. Toutefois, pour relativement grandes orgues porcins, ces approches sont impraticable et enclin à l’imprécision, car ils nécessitent des flacons volumétrique/de mesure très large. Plus commodément, le volume d’un organe/tissu peut être calculé à partir de son poids et la densité^7,12,16, qui peut efficacement être déterminé à l’aide de la « méthode de submersion »^{7,12 ,16} (étape de protocole 1.1.). Volumes d’organes et de tissus peuvent également être estimés à l’aide de la volumétrie des approches basées sur le « principe de Cavalieri » (1598-1647). En termes simples, le principe de Cavalieri stipule, que si deux objets sont sectionnées dans des plans parallèles à un plan de masse, et les profils des sections coupent par le biais de deux objets au correspondant distance depuis le plan de masse ont les mêmes zones, les deux objets ont le même volume. Ainsi, on peut estimer le volume d’objets façonnés arbitrairement comme le produit de leurs zones de profil de section dans les plans de coupe parallèle, tout aussi lointain et la distance entre les plans de coupe. C’est compréhensible avec l’analogie suivante : considérons deux cheminées comprenant le même nombre de pièces identiques sont placées côte à côte, une pile avec la pièces de monnaie ordonnée empilée les uns sur les autres ce qui donne une forme cylindrique de la pile de la pièce et l’autre empilement de pièces de monnaie avec décentré placé pièces (Figure 3 a). Bien que les formes des deux cheminées de la pièce sont différents, leurs volumes sont identiques, depuis les zones des pièces à des niveaux correspondants de deux piles (c’est-à-direles zones des profils de sections parallèles coupent par les deux cheminées de la pièce à égale distance de la au sol) sont identiques. Estimation des volumes d’organes porcins et de tissus en utilisant le principe de Cavalieri^7,12,15 est décrit à l’étape 1.2.

Détermination de l’étendue du retrait des tissus associé à enrobage histologique
Dans les analyses de plusieurs paramètres morphologiques quantitatifs mesurés dans des coupes de tissus histologiques, l’effet de rétraction tissulaire liées à enrobage survenant pendant le traitement pour l’histologie des tissus doit être déterminé et pris en compte. L’ampleur du retrait de tissu liées à enrobage peut être variable et dépend à la fois sur le tissu, son traitement et l’incorporation moyenne^{8,13,17,18,19}. Généralement, les changements liés à enrobage du volume d’un échantillon de tissu (c’est-à-dire, pour la plupart de rétrécissement) se produisent dans les trois dimensions de l’espace et, par conséquent, affecte tous les paramètres dimensionnels estimées par des analyses quantitatives stéréologiques⁸ . Fondamentalement, l’ampleur du retrait de tissu incorporation liées, exprimé comme le facteur de rétrécissement des tissus linéairef_S, peut être estimée comme indiqué dans l’étape 1.3. et utilisés pour la correction des paramètres morphologiques quantitatifs (rétrécissement sensible)¹⁴.

Échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume des organes/tissus
Création d’une biobanque de collection des échantillons d’organes et de tissus porcins, approches d’échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume tel que décrits à l’étape 2 se sont avérés pour être pratiques, rapide et efficaces des techniques de génération de représentant, tissu multi-usage échantillons^7,8,9,15.

Génération d’isotrope uniforme aléatoire et des sections verticales uniforme aléatoire pour les analyses quantitatives stéréologiques
Biobank échantillons de tissus doivent être adapté pour un large éventail de méthodes différentes analyse stéréologique quantitative pour l’estimation d’un maximum de paramètres qui ne peut être déterminée sans un spécimen bien préparé. Presque tous les paramètres stéréologiques quantitatives peuvent être déterminés, en utilisant « isotrope (indépendant) uniforme aléatoire (IUR) sections »^8,9. Dans les sections IUR, l’orientation tridimensionnelle du plan de la section de l’échantillon de tissu est aléatoire. Ceci peut être réalisé par randomisation de la position de l’échantillon de tissu par rapport à la position de l’avion de la section, tel qu’appliqué dans le « Isector » méthode¹¹ (étape 3.1 du protocole), ou par randomisation de l’orientation du plan de la section relative à la échantillon de tissu, comme dans la méthode « Orienteur »¹⁰ (étape 3.2 du protocole). Dans les échantillons de tissus, comme la peau ou la muqueuse spécimen affichant un axe vertical naturellement présent, ou défini et correctement identifiable, préparation des « vertical uniforme aléatoire (RVU) sections » (pas de protocole 3.3.) sectionné strictement dans le plan de leur axe vertical est avantageuse^8,20. Pour un discours complet des fondements théoriques de l’échantillonnage IUR/VUR et un examen approfondi des potentiels en aval analyses stéréologiques quantitatives, le lecteur intéressé est dénommé les manuels de stéréologie quantitative dans la vie Sciences^8,9.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici utilisent des échantillons de tissus provenant d’animaux morts et respectez les réglementations allemandes du bien-être animal. 1. volumétrie Technique d’immersion pour la détermination de la densité de tissu ou d’organe (Figure 1 et Figure 2) 7 , 12 , <sup …

Representative Results

Technique d’immersion pour détermination de la masse de tissus ou d’organes Figure 12 a -B montre la détermination représentative de la densité et le volume d’un rein de porc en utilisant la technique d’immersion décrite à l’étape 1.1 (Figure 1, Figure 2). Des résultats plus représentatifs des mesures de la …

Discussion

Génération des collections échantillon biobanque de modèles animaux porcins nécessite des techniques robustes et protocoles pour la détermination des volumes d’organes et de tissus, la génération reproductible de représentant, des échantillons de tissu redondant convenant à un large éventail de Méthodes d’analyse différentes et pour la randomisation de l’orientation des sections d’échantillon pour des analyses quantitatives stéréologiques. Les méthodes décrites dans le présent article sont ada…

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.