Prøvetaking strategier og behandling av Biobank fra svin biomedisinsk modeller

Summary

Praktisk programmet og gjennomførelse av metoder for generering av representant av svin dyremodeller for et bredt spekter av nedstrøms analyser i biobank prosjekter er vist, inkludert volumetry, systematisk stikkprøvekontroll, og differensial behandling av vevsprøver for kvalitativ og kvantitativ morfologiske og molekylære analyser typer.

Abstract

I medisinsk translasjonsforskning, har svin modeller stadig blitt mer populært. Vurderer den høye verdien av enkelte dyr, spesielt av genmodifiserte gris modeller, og ofte begrenset antall tilgjengelige dyr disse modellene, etablering av (biobank) samlinger av tilstrekkelig behandlet egnet for en bredt spekter av påfølgende analyser metoder, inkludert analyser ikke angitt på tidspunkt for prøvetaking, representerer meningsfull tilnærminger til å dra full nytte av translasjonsforskning verdien av modellen. Med hensyn til peculiarities av svin anatomi, er omfattende retningslinjer nylig etablert for standardisert generasjon av representant, høy kvalitet prøver fra ulike svin organer og vev. Disse retningslinjene er avgjørende forutsetninger for reproduserbarhet resultater og sammenlignbarheten mellom forskjellige studier og etterforskere. Innspillingen av grunnleggende data, for eksempel orgel vekter og volumer, fastsettelse av prøvetaking plasseringer og antall vevsprøver genereres, samt deres retning, størrelse, behandling og trimming retninger, er relevante faktorer avgjøre generalizability og brukervennlighet av prøven for molekylær, kvalitativ og kvantitativ morfologiske analyser. Her, en illustrasjon, praktisk, trinnvis demonstrasjon av de viktigste teknikkene for generering av representant, multi-purpose biobank prøven fra svin vev er presentert. Metodene som er beskrevet her inkluderer fastsettelse av orgel/vev volumer og tettheter, anvendelse av en volum-vektet systematisk stikkprøvekontroll prosedyre for parenchymal organer av punkt-telling, bestemmelse av omfanget av vev krymping relatert til histologiske innebygging av eksempler og generering av tilfeldig orientert prøver for kvantitative stereological analyser, for eksempel isotropic uniform tilfeldig (IUR)-inndelinger generert av “Orientator” og “Isector”, og loddrette uniform tilfeldig (VUR) deler.

Introduction

I translasjonsforskning medisin, griser er stadig mer vanlig for bruk som stor dyr modeller^1,2,3,4,5, på grunn av flere fordelaktig likheter mellom den svin og Human anatomi og fysiologi, og tilgjengeligheten av etablerte molekylærbiologiske metoder tillater generering av skreddersydd, genmodifiserte gris modeller for en rekke sykdom forhold^1,4.

Men er sammenlignet med gnager modeller, antall dyr av respektive gris modell som kan brukes i eksperimenter helst begrenset. Dette skyldes svin generasjon intervallet av ca ett år, og de finansielle og tidkrevende arbeid kreves for generasjonen av svin modeller og husdyrhold. Derfor er enkelte dyr porcine modell, i tillegg til prøvene som kan genereres fra disse griser, svært verdifulle, særlig hvis genmodifiserte svin modeller og/eller langsiktig eksperimentelle spørsmål (f.eks, sent komplikasjoner av kroniske sykdommer) undersøkt i alderen enkeltpersoner^2,6,7.

I en studie, ytelse av flere analyser som ikke hadde planlagt i første eksperimentell design av studien kan senere viser seg for å være relevant, f.eksadresse forskjellige spørsmål som oppstår fra tidligere oppdaget uventede funn. Hvis egnet prøver for slike ekstra eksperimenter ikke er tilgjengelig, kan det hende uforholdsmessig høy pris og tidkrevende utgifter nødvendig å generere flere griser og vevsprøver. For å være forberedt for Slike eventualiteter, generasjon av biobank bevarte sikkerhetskopiere prøver av ulike organer og vev bio-væsker, kvalitativt og kvantitativt egnet for en rekke etterfølgende analyser, er ansett som en viktig nærme^2,6,7. Avledet optimal fordeler fra en svin dyremodell, anvendeligheten av adekvat biobank prøver tilbyr også unike muligheten til å utføre et bredt spekter av forskjellige analyseteknologi på identiske utvalg materialer på flere organ nivå i den samme enkelte dyr, f.eksav distribusjon å forskere av ulike arbeidsgrupper organisert i en forskning nettverk^2,6,7. I tillegg bidrar ” fremtidsrettede ” prøvetaking strategien i biobanking også til en reduksjon i antall dyr nødvendig i en studie. Fordelene med porcine modell biobanking er nylig blitt demonstrert i en multi organ, multiomics Studien undersøker orgel cross-talk i genmodifiserte porcine modell for langsiktige diabetes mellitus, med prøver fra München MIDY gris Biobank ².

Det er noen obligatorisk krav biobank prøver må vanligvis overholde for å etablere pålitelighet og interpretability av resultatene av de senere utføres analysene. Prøvene må genereres reproduserbar, og de må representant, dvstilstrekkelig reflekterer interessert morfologiske og molekylære funksjonene i vev/orgel prøvene er tatt fra⁷. For å være egnet for en rekke nedstrøms analysetyper, må prøvene være tatt i tilstrekkelige mengder og bearbeidet etter kravene (inkludert tid og temperatur) av forskjellige analytiske metoder, inkludert beskrivende histopathological analyser, som cryohistology, parafin og plast histology, immunohistochemistry, i situ hybridisering, ultrastructural elektron mikroskopiske analyser og kliniske laboratoriet diagnostiske analyser, så vel som molekylær analyser av DNA, RNA, proteiner og metabolitter.

Som tillater for vurdering av en rekke forskjellige kvantitative morfologiske parametere som tall, volum, lengde eller flater av ulike vev strukturer av kvantitative stereological analyser, randomisert delen fly av den histologiske prøver av respektive organer/vev må være forberedt^7,8,9,10,11. Kvantitativ morfologiske studier, nøyaktig bestemmelse av det totale volumet av vev, orgel eller orgel kupeen, prøvene var tatt fra (i.e.referanse plass) er avgjørende viktig^{7,9 , 12} for å beregne den absolutte mengder parameterne interessert i de respektive orgel, vev eller organisme. Til slutt, har effekten av bygge-relatert vev krymping av histologiske deler bestemt og tatt konto¹³. Derfor er kvantitative stereological analyser, spesielt med arkiverte prøver (fast vevsprøver, innebygde vev blokker, histologiske deler, etc.) fra tidligere studier sterkt begrenset eller umulig¹², spesielt hvis volumetry av respektive organer/vev ikke ble utført, hvis ingen tilstrekkelig utvalg design ble brukt til å rettferdiggjøre representative utvalg, hvis tallene og mengder av tilgjengelige personlige prøver er ikke nok, eller hvis behandlingen av den Eksempler er inkompatibel med estimering av parameteren(e) kvantitative morfologiske rundt. De mange mulige påvirker faktorene hensiktsmessigheten av arkiv utvalg materiale for analyser av forskjellige kvantitative morfologiske parametere kan ikke utvetydig besvares, men avhenger nøye vurdering av hvert enkelt tilfelle.

Dermed som plasseringen, størrelsen, antall, behandling, trimming retning og orientering av prøvene vil påvirke resultatene av påfølgende analysene, disse faktorene er av stor betydning og må vurderes i eksperimentell design av noen studier. Disse aspektene og de spesielle funksjonene i den svin anatomien, omfattende, detaljert, omfattende utvalg retningslinjer tilpasset svin dyremodeller har nylig blitt opprettet, gir en robust referanse til standardisert, reproduserbare , og effektiv generasjon av overflødig, tilstrekkelig behandlet, høy kvalitet prøver fra mer enn 50 forskjellige svin organer og vev^6,7.

Metodologiske beskrivelsene og videodemonstrasjon vises i denne artikkel gir detaljert, illustrasjon, forståelig, steg-for trinnvise instruksjoner for praktisk ytelse av en rekke teknikker for volumetry, prøvetaking av svin vev og organer og behandling av vevsprøver for nedstrøms analyse metoder. Utvalgte teknikkene omfatter metoder for fastsettelse av orgel/vev volumer og tettheter basert på prinsippene om Arkimedes og Cavalieri⁹, herunder fastsettelse av dimensjonene for tredimensjonale krymping av vev gjelder de innebygging i forskjellige innebygging media¹⁴ under behandlingen for histologiske eksamen, anvendelse av praktisk volum-vektet systematisk tilfeldig utvalg tilnærminger, behandling av samplet vevsprøver for ulike etterfølgende analyser^7,8,9,15, og generasjon riktig orientert og behandlet prøver for potensielle kvantitative stereological analyser^{7,8, 9,10,11}. Ved sin søknad i svin biobank prosjekter er demonstrerte metodene generelt passende for alle studier undersøke kvantitative histo-morfologiske egenskaper av organer/vev. Videre er systematisk stikkprøvekontroll design spesielt nyttige for generering av representative utvalg eksperimenter bruker molekylær analyseteknologi for å oppdage overflod endringer av f.eks, RNAs, proteiner og metabolitter i ulike organer og vev.

De neste avsnittene gir en kort introduksjon til disse metodene, mens praktiske resultatene er beskrevet i delen protokollen.

Fastsettelse av orgel/vev volumer
Fastsettelse av orgel vekter og volumer er viktig i flere eksperimentelle innstillinger, som disse faktorene kan bety endringer, potensielt eksperimentelt undersøkt faktorer av interesse. Det totale volumet av en orgel/vev er også ofte nødvendig å beregne absolutt kvantitative parametere, (f.eks, hvor total-celle) fra stereologically beregnede numeriske volum tettheter (dvs., antall celler per Volumenhet av vev)^7,12. Bortsett fra teknikker bruker komplekse tekniske utstyr, slik som konstatere, det er i utgangspunktet tre praktiske metoder som vanligvis brukes til å bestemme den absolutte mengden et organ eller vev. Volumet av et organ kan bestemmes av “direkte volumetriske measurement” i henhold til prinsippet om Arkimedes, dvs, måle volumet av vann eller saltløsning fortrengt av strukturen når helt neddykket. Men for relativt store svin organer er disse tilnærmingene upraktisk og utsatt for upresisjonsverdier, siden de krever stor volumetriske/måle flasker. Mer praktisk, volumet av en orgel/vev kan beregnes fra sin vekt og tetthet^7,12,16, som kan effektivt bestemmes ved hjelp av “neddykking metoden”^{7,12 ,16} (protokollen trinn 1.1.). Orgel/vev volumer kan også estimeres ved hjelp av volumetry tilnærminger basert på “prinsippet om Cavalieri” (1598-1647). Enkelt sagt, Cavalieri prinsippet sier, at hvis to objekter er delt i fly parallelt med et grunnplan og profiler av delene skjære gjennom to objekter på tilsvarende avstand til på grunnplan har de samme områdene, to objekter har samme volum. Dermed kan volumet av vilkårlig formet objekter anslås som produktet av deres delen profil områder i parallell, like fjernt delen fly og avstanden mellom avsnittet flyene. Dette er forståelig med følgende analogien: Tenk to stabler bestående av samme antall identiske mynter er plassert side ved side, en stabel med mynter ryddig stablet oppå hverandre gir sylinderform mynt stabelen, og den andre stabel med mynter med midtstilt plassert mynter (figur 3A). Selv om formen på begge mynt stabler er forskjellige, volumene er den samme, siden områdene mynter på tilsvarende nivåer av begge stabler (i.e.områdene profiler av parallelle skjære gjennom begge mynt stabler i samme avstand fra den bakken) er identiske. Estimering av volum av svin organer og vev bruker Cavalieri prinsipp^7,12,15 er beskrevet i trinn 1.2.

Fastsettelse av omfanget av vev krymping knyttet til histologiske innebygging
Analyser av flere kvantitative morfologiske parametere målt i histologiske vev deler, har effekten av bygge-relatert vev krymping forekommer under vev behandling for histology bestemt og tatt hensyn til. Omfanget av bygge-relatert vev krymping kan være variabel, og avhenger både på vevet, behandlingen og innebygging middels^{8,13,17,18,19}. Generelt forekommer bygge-relaterte endringer av volumet av en Vevsprøve (dvsdet meste krymping) i alle tre dimensjoner av plass, og derfor påvirker alle dimensjonale parametrene anslått av kvantitative stereological analyser⁸ . I utgangspunktet kan omfanget av bygge-relatert vev krymping, uttrykt som den lineære vev krymping faktoren (f_S), anslås som vist i trinn 1.3. og brukes for korreksjon (krymping-sensitive) kvantitative morfologiske parametere¹⁴.

Volum-vektet systematisk tilfeldig utvalg av organer/vev
For etableringen av en biobank samling av svin orgel/vevsprøver, volum-vektet systematisk stikkprøvekontroll tilnærminger som beskrevet i trinn 2 har vist seg for å være praktisk, tidsbesparende og effektive teknikker for generering av representant, Multi-Purpose vev eksempler^7,8,9,15.

Generasjons Isotropic Uniform tilfeldig deler og loddrett Uniform tilfeldig seksjoner for kvantitative stereological analyser
Biobank vevsprøver må være egnet for en rekke stereological kvantitativ analyse metoder for estimering av antallet parametere som ikke kunne fastslås uten en tilstrekkelig forberedt prøven. Nesten alle kvantitativt stereological parametere kan bestemmes, bruker “isotropic (uavhengig) uniform tilfeldig (IUR) kapitler”^8,9. I IUR deler, er tredimensjonale retningen for inndelingsplanet av vev utvalget randomisert. Dette kan oppnås ved tilfeldiggjøring av stillingen vevet prøven i forhold til inndelingsplanet, som brukes i “Isector” metoden¹¹ (protokollen trinn 3.1), eller av tilfeldiggjøring av retningen for inndelingsplanet forhold til den Vevsprøve, som “Orientator” metoden¹⁰ (protokollen trinn 3.2). I vevsprøver, for eksempel hud- eller mucosa prøven viser en naturlig tilstede, eller definert og riktig identifiserbar loddrett akse, utarbeidelsen av “vertikal uniform tilfeldig (VUR) kapitler” (protokollen trinn 3.3.) strengt delt i fly av deres loddrett akse er fordelaktig^8,20. For en komplett diskurs av teoretiske grunnlaget for IUR/VUR prøvetaking og en omfattende diskusjon om potensielle nedstrøms kvantitative stereological analyser kalles den interesserte leseren lærebøker av kvantitative stereology i livet Sciences^8,9.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet bruker her vevsprøver avledet fra døde dyr og overholde tyske forskrifter av dyr velferd. 1. Volumetry Neddykking teknikk for fastsettelse av vev/orgel tettheter (figur 1 og figur 2) 7 , 12 , 16 Forberede materialer: skalpell blader, papirh…

Representative Results

Neddykking teknikk for fastsettelse av vev/orgel Figur 12A -B viser representant fastsettelse av tetthet og volum for en svin nyre bruke neddykking teknikken beskrevet i trinn 1.1 (figur 1, figur 2). Mer representativt resultatene av tetthet målinger av flere svin organer og vev er presentert i tabell 2. En m…

Discussion

Generasjon av biobank prøvekolleksjoner fra svin dyremodeller krever robust teknikker og protokoller for fastsettelse av orgel/vev volumer, reproduserbare generering av representant, redundant vevsprøver egnet for en rekke analyse metoder, og for tilfeldiggjøring av retningen for eksempel deler for kvantitative stereological analyser. Metodene som er beskrevet i denne artikkel er tilpasset størrelsen på svin organer og vev, og er utviklet for å effektivt møte disse kravene^2,<sup …

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.