Estratégias de amostragem e processamento de amostras de tecido do Biobanco de suínos modelos biomédicos

Summary

A aplicação prática e o desempenho dos métodos para geração de amostras representativas de modelos animais suínos para um amplo espectro de análises a jusante em biobanco projetos são demonstradas, incluindo volumetria, amostragem aleatória sistemática, diferencial e processamento de amostras de tecidos para tipos de análises qualitativas e quantitativas de morfológico e molecular.

Abstract

Na pesquisa médica translacional, porcinos modelos constantemente tornaram-se mais populares. Atendendo ao elevado valor de animais individuais, particularmente de porcos geneticamente modificados, modelos e muitas vezes limitado número de animais disponíveis desses modelos, criação de coleções (biobanco) de amostras de tecido adequadamente processados adequado para uma amplo espectro de métodos de análises subsequentes, incluindo análises não especificadas no ponto de tempo de amostragem, representam abordagens significativas para aproveitar ao máximo do valor do modelo de translação. Sobre as especificidades da anatomia porcina, orientações abrangentes recentemente foram estabelecidas para geração padronizada de representante, amostras de alta qualidade de tecidos e órgãos diferentes de suínos. Essas diretrizes são pré-requisitos essenciais para a reprodutibilidade dos resultados e a sua comparabilidade entre diferentes estudos e investigadores. A gravação de dados básicos, como pesos de órgão e volumes, a determinação dos locais de amostragem e do número de amostras de tecido para ser gerado, bem como sua orientação, tamanho, processamento e direções de aparamento, é fatores relevantes determinação da generalização e da usabilidade da amostra para análise morfológica molecular, qualitativa e quantitativa. Aqui, uma demonstração ilustrativa, prática, passo a passo das técnicas mais importantes para a geração de representante, espécime biobanco de múltiplos propósitos de tecidos dos suínos é apresentado. Os métodos descritos aqui incluem a determinação de volumes de órgão/tecido e densidades, a aplicação de um procedimento de amostragem aleatória sistemática volume ponderado para órgãos parenquimatosos por contagem de ponto, determinação do grau de encolhimento de tecido relacionados à incorporação histológica de amostras e geração de amostras aleatoriamente orientadas para análises stereological quantitativas, tais como seções (IUR) isotrópicas uniformes aleatórias geradas pelos métodos “Orientadores” e “Isector” e uniforme vertical seções de (RVU) aleatórias.

Introduction

Em medicina translacional, os porcos são cada vez mais comuns para o uso como animal grande modelos^1,2,3,4,5, devido a várias semelhanças vantajosas entre o suíno e anatomia humana e fisiologia e a disponibilidade de métodos biológicos moleculares estabelecidos, permitindo a geração de adaptados, geneticamente modificado modelos de porco para uma ampla gama de condições de doença^1,4.

No entanto, em comparação com modelos de roedores, o número de animais de um modelo de porco respectivos que podem ser fornecidos para experiências em qualquer momento é limitado. Isto é devido o intervalo de geração de suíno de cerca de um ano e os esforços financeiros e demorada necessários para a geração de modelos de suínos e criação de animais. Portanto, animais individuais de um modelo de suínos, bem como os exemplos que podem ser gerados a partir destes porcos, são muito valiosos, particularmente se geneticamente modificado modelos suínos e/ou a longo prazo problemas experimentais (por exemplo, complicações tardias de doenças crônicas) são examinadas em indivíduos envelhecidos^2,6,7.

No decurso de qualquer estudo, desempenho de análises adicionais, que não tinha sido prevista no projeto inicial do estudo experimental pode mais tarde tornar-se relevante, por exemplo, para endereço distintas questões decorrentes anteriormente descobertos resultados inesperados. Se amostras adequadas para tais experimentos adicionais não estão disponíveis, desproporcionalmente alto custo e demorada despesas talvez seja necessárias gerar porcos adicionais e amostras de tecido. Para estar preparado para tais eventualidades, geração de biobanco coleções de conservadas amostras de backup de diferentes órgãos, tecidos ou bio-líquidos, quantitativamente e qualitativamente adequados para uma ampla gama de análises posteriores, é considerada uma importante abordagem^2,6,7. Óptimos benefícios derivar um modelo animal de suínos, a disponibilidade de amostras adequadas biobanco também oferece a possibilidade única de realizar um amplo espectro de métodos de análise de diferentes materiais de amostra idêntico ao órgão multi nível na mesma determinados animais, por exemplo, pela distribuição de amostras aos cientistas de diferentes grupos de trabalho organizados em uma rede de pesquisa^2,6,7. Além disso, a estratégia de amostragem ‘ progressista ‘ em biobanking também contribui para a redução do número de animais necessários para um estudo. As vantagens do modelo porcina biobanking recentemente foram demonstradas em um órgão multi, multiomics estudo, examinando o órgão conversas cruzadas em um modelo de suínos geneticamente modificado de longo prazo de diabetes mellitus, usando amostras a partir de Munique MIDY porco biobanco ².

Existem alguns requisitos obrigatórios biobanco amostras geralmente devem cumprir para estabelecer a confiabilidade e interpretabilidade dos resultados das análises realizadas posteriormente. As amostras devem ser geradas reproducibly, e devem ser adequadamente representante, isto é, refletindo as características morfológicas e moleculares interessadas do órgão/tecido as amostras foram colhidas de⁷. Para ser apropriado para uma ampla gama de tipos de análise a jusante, as amostras devem ser tomadas em quantidades suficientes e processadas de acordo com as exigências (incluindo condições de tempo e temperatura) dos diferentes métodos analíticos, incluindo descritivo análises histopatológicas, tais como cryohistology, parafina e histologia plástica, imuno-histoquímica, hibridação in situ , análises microscópicas de elétron ultraestrutural e análises de diagnóstico de laboratório clínico, bem como moleculares análises de DNA, RNA, proteínas e metabólitos.

Para permitir a avaliação de uma vasta gama de distintos parâmetros morfológicos quantitativos como números, volumes, comprimentos ou áreas de superfície de estruturas distintas de tecido por análises quantitativas de stereological, randomizada seção aviões do amostras histológicas dos respectivos órgãos/tecidos precisam estar preparados^7,8,9,10,11. Em estudos quantitativos morfológicos, a determinação precisa do volume total do tecido, órgão ou compartimento do órgão, as amostras foram retiradas (ou seja, o espaço de referência) é de importância crucial^{7,9 , 12} para calcular as quantidades absolutas dos parâmetros dentro do respectivo órgão, tecido ou organismo interessados. Eventualmente, o efeito de encolhimento de tecidos relacionados com incorporação durante a preparação de cortes histológicos tem de ser determinado e tidos em conta¹³. Portanto, análises stereological quantitativas, especialmente das amostras arquivadas (fixada amostras de tecido, tecido incorporado blocos, cortes histológicos, etc.) dos estudos anteriores são, por vezes, severamente limitada ou mesmo impossível¹², particularmente se a volumetria dos respectivos órgãos/tecidos não foi realizada, se não há projetos de amostragem adequado foram aplicados para mandado de amostras representativas, se os números e quantidades de amostras individuais disponíveis são insuficientes, ou se o tratamento da amostras é incompatível com a estimativa do quantitativo de parâmetros morfológico de interesse. Devido aos múltiplos fatores influenciam possíveis, a adequação dos materiais de arquivo-amostra para análises de parâmetros morfológicos quantitativos distintos inequivocamente não pode ser respondida, mas depende da avaliação criteriosa de cada caso.

Assim, como a localização, tamanho, número, processamento, direção de aparar e orientação de amostras potencialmente irão afectar os resultados das análises subsequentes, esses fatores são de grande importância e devem ser considerados no projeto experimental de qualquer estudo. No que se refere estes aspectos e as particularidades da anatomia porcina, orientações de amostragem abrangente, detalhado e em grande escala recentemente foram estabelecidos modelos animais adaptados para suínos, fornecendo uma referência robusta para padronizado, reprodutível e eficiente geração de amostras redundantes, adequadamente processadas, alta qualidade de mais de 50 diferentes porcina órgãos e tecidos^6,7.

As descrições metodológicas e o tutorial em vídeo mostrado no presente artigo fornecem detalhadas, ilustrativos, compreensível, passo-a-passo as instruções para desempenho prático de uma variedade de técnicas de volumetria, colheita de amostras de tecidos de suínos e órgãos e processamento de amostras de tecido para métodos diferentes de análise a jusante. As técnicas de destaque incluem métodos para determinação de volumes de órgão/tecido e densidades, baseadas nos princípios de Arquimedes e Cavalieri⁹, incluindo a determinação das dimensões do encolhimento tridimensional de tecido relacionadas com o incorporação em diferentes encastre mídia¹⁴ durante o processamento para exame histológico, aplicação do praticável volume ponderado sistemática amostragem aleatória se aproxima, processamento de amostras de amostra para diferentes subsequentes análises^7,8,9,15e geração de devidamente orientado e processadas amostras para análises quantitativas de stereological potenciais^{7,8, 9,10,11}. Ao lado de sua aplicação em projetos de suínos biobanco, os métodos comprovados são geralmente apropriados para todos os estudos examinando Propriedades quantitativas de histo-morfológica de órgãos/tecidos. Além disso, projetos de amostragem aleatória sistemática são particularmente benéficos para geração de amostras representativas em experimentos utilizando métodos de análise molecular para detectar alterações de abundância de, por exemplo, RNAs, proteínas ou metabólitos em vários órgãos e tecidos.

Os próximos parágrafos fornecem uma breve introdução a estes métodos, enquanto seu desempenho prático é descrito na seção de protocolo.

Determinação de volumes de órgão/tecido
Determinação de volumes e pesos de órgãos é importante em várias configurações de experimentais, como esses fatores podem indicar alterações, potencialmente relacionadas com experimentalmente examinaram fatores de interesse. O volume total de um órgão/tecido também comumente é necessária para calcular parâmetros quantitativos absolutos, (por exemplo, o número total de células), de densidades de volume numérico stereologically estimado (ou seja, o número de células por unidade de volume de tecido)^7,12. Além de técnicas usando equipamentos técnicos complexos, tais como tomografias computadorizadas, existem basicamente três métodos práticos comumente usados para determinar o volume absoluto de um órgão ou tecido. O volume de um órgão pode ser determinado por “medição volumétrica direta” de acordo com o princípio de Arquimedes, ou seja, a medição do volume de água ou solução salina deslocadas pela estrutura quando completamente submersa. Entretanto, para comparativamente grandes órgãos de suínos, essas abordagens são impraticáveis e propenso a imprecisão, já que exigem grande volumétrico/medição de balões. Mais convenientemente, o volume de um órgão/tecido pode ser calculado a partir de seu peso e densidade^7,12,16, que eficientemente pode ser determinado usando o “método de submersão”^{7,12 ,16} (etapa de protocolo 1.1.). Volumes de órgão/tecido também podem ser estimados utilizando abordagens volumetria baseadas no “princípio de Cavalieri” (1598-1647). Em termos simples, o princípio de Cavalieri afirma, que, se dois objetos são seccionados em planos paralelos a um plano de terra, e os perfis das seções cortam-se os dois objetos no correspondente distâncias desde o plano de chão tem as mesmas áreas, os dois objetos tem o mesmo volume. Assim, o volume de objetos arbitrariamente em forma pode ser calculado como o produto de suas áreas de perfil seção em planos de corte paralelos, igualmente distante e a distância entre os planos de secção. Isto é compreensível, com a seguinte analogia: considere duas pilhas consiste o mesmo número de moedas idênticas são colocadas lado a lado, uma pilha com o enfermeiro de moedas empilhado um sobre o outro, produzindo uma forma cilíndrica de pilha de moedas e o outro pilha de moedas com descentralizado posicionado moedas (Figura 3A). Embora as formas de ambas as pilhas de moedas são diferentes, seus volumes são iguais, desde as áreas das moedas em níveis correspondentes de ambas as pilhas (ou seja, as áreas de perfis de secções paralelas de cortar através de duas pilhas de moedas em distâncias iguais da à terra) são idênticos. Estimativa dos volumes de suínos órgãos e tecidos, usando o Cavalieri princípio^7,12,15 é descrita na etapa 1.2.

Determinação do grau de encolhimento de tecidos relacionado à incorporação histológica
Nas análises de vários parâmetros morfológicos quantitativos medidos em secções histológicas do tecido, o efeito de retração de tecido incorporação relacionados ocorrem durante o processamento para a histologia de tecido deve ser determinada e tidos em conta. O grau de encolhimento relacionados com incorporação de tecido pode ser variável e depende tanto sobre o tecido, seu processamento e a incorporação média^{8,13,17,18,19}. Geralmente, alterações relacionadas com a incorporação do volume de uma amostra de tecido (ou seja, principalmente de encolhimento) ocorrem em todas as três dimensões do espaço e, portanto, afeta todos os parâmetros dimensionais estimados por análises quantitativas de stereological⁸ . Basicamente, o grau de encolhimento de tecidos relacionados com incorporação, expressado como o fator de encolhimento de tecido linear (f_S), pode ser estimado como mostrado na etapa 1.3. e usado para a correção dos parâmetros morfológicos quantitativos (encolhimento-sensível)¹⁴.

Volume ponderado amostragem aleatória sistemática dos órgãos/tecidos
Criação de uma coleção de biobanco de amostras de suínos órgão/tecido, abordagens de amostragem aleatória sistemática volume ponderada como descritas na etapa 2 provaram para ser práticas, economia de tempo e eficientes técnicas para geração de representante, ^7,8,9,15de amostras de tecido de múltiplos propósito.

Geração de seções isotrópico uniforme aleatório e seções verticais uniforme aleatório para análises quantitativas de stereological
Amostras de tecido do Biobanco precisam ser apropriado para uma ampla gama de métodos de análise stereological quantitativos diferentes para estimativa de um máximo de parâmetros que não pôde ser determinado sem um espécime adequadamente preparado. Quase todos os parâmetros quantitativos de stereological podem ser determinados, usando “isotrópica (independente) uniforme aleatório (IUR) seções”^8,9. Nas seções IUR, a orientação tridimensional do plano de corte da amostra de tecido é aleatório. Isto pode ser conseguido por randomização da posição da amostra de tecido em relação à posição do avião seção, como aplicado na “Isector” método¹¹ (passo 3.1 do protocolo), ou por randomização da orientação do plano relativo a secção a amostra de tecido, como o método de “Orientadores”¹⁰ (passo 3.2 do protocolo). Em amostras de tecidos, tais como pele ou mucosa espécime exibindo um eixo vertical naturalmente presente, ou definido e devidamente identificável, preparação de “vertical uniforme aleatório (RVU) seções” (etapa de protocolo 3.3.) estritamente seccionado dentro do plano de sua eixo vertical é vantajoso^8,20. Para um discurso completo dos fundamentos teóricos da amostragem de IUR/RVU e uma discussão abrangente de potenciais a jusante análises quantitativas de stereological, o leitor interessado é referido nos livros de stereology quantitativa na vida Ciências^8,9.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui usam amostras de tecido derivadas de animais mortos e em total conformidade com os regulamentos legais alemãs do bem-estar animal. 1. a volumetria Técnica de submersão para a determinação das densidades de tecido/órgão (Figura 1 e Figura 2) 7 , 12 , <sup class="xre…

Representative Results

Técnica de submersão para determinação da densidade do tecido/órgão Figura 12A -B mostra a determinação representativa da densidade e do volume de um rim suíno utilizando a técnica de submersão descrita no passo 1.1 (Figura 1, Figura 2). Resultados mais representativos das medições de densidade de tecidos e órgã…

Discussion

Geração de coleções de amostra biobanco de modelos animais suínos requer técnicas robustas e protocolos para a determinação dos volumes de órgão/tecido, a geração pode ser reproduzida de representante, amostras de tecido redundante apropriadas para uma ampla gama de métodos de análise diferentes e para randomização da orientação das seções de amostra para análises quantitativas de stereological. Os métodos descritos no presente artigo são adaptados para os tamanhos de suínos órgãos e tecidos e f…

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.