Estrategias de muestreo y procesamiento de las muestras de tejido de Biobanco de porcinos modelos biomédicos

Summary

La aplicación práctica y el rendimiento de métodos para la generación de muestras de tejido representativo de modelos animales porcinos para un amplio espectro de análisis aguas abajo en el Banco de proyectos se demuestran, incluyendo volumetría, muestreo al azar sistemático, y procesamiento de muestras de tejido de tipo cualitativo y cuantitativo análisis morfológicos y moleculares de diagnóstico.

Abstract

En la investigación médica aplicada, modelos porcinos constantemente han vuelto más populares. Considerando el alto valor de cada animal, particularmente de cerdos genéticamente modificados modelos y a menudo limitado número de animales disponibles de estos modelos, establecimiento de colecciones (Biobanco) de muestras de tejido adecuadamente procesado adecuado para un amplio espectro de métodos de análisis posteriores, incluyendo análisis no especificados en el momento del muestreo, representan enfoques significativos para aprovechar al máximo el valor traslacional del modelo. Con respecto a las peculiaridades de la anatomía porcina, recientemente han establecido directrices amplias para generación estandarizado de representante, muestras de alta calidad de diferentes órganos porcinos y tejidos. Estas directrices son indispensables para la reproducibilidad de los resultados y su comparabilidad entre diferentes estudios e investigadores. La grabación de los datos básicos, como el órgano pesos y volúmenes, la determinación de los lugares de muestreo y de los números de las muestras de tejido que se generen, así como su orientación, tamaño, proceso y direcciones de ajuste, es factores relevantes determinar la generalización y la utilización de la muestra para análisis morfológicos moleculares, cualitativas y cuantitativas. Aquí, se presenta una demostración ilustrativa, práctica, paso a paso de las técnicas más importantes para la generación de representante, espécimen multiuso Biobanco de tejidos porcinos. Los métodos aquí descritos incluyen la determinación de volúmenes de órganos y tejidos y densidades, la aplicación de un procedimiento de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen de órganos parenquimales por punto de conteo, la determinación del grado de contracción de tejido relacionadas con la fijación histológica de las muestras y la generación de muestras aleatoriamente orientadas para análisis estereológicos cuantitativos, como isotrópica uniforme aleatorio (IUR) las secciones generadas por los métodos de “Orientador” y “Isector” y vertical uniforme aleatorias secciones (VUR).

Introduction

En la medicina traslacional, los cerdos son cada vez más común para el uso como modelos de animales grandes^1,2,3,4,5, debido a varias ventajas similitudes el porcino y anatomía humana y fisiología y la disponibilidad de métodos biológicos moleculares establecidos permitiendo generación de adaptados, modificados genéticamente modelos de cerdo para una amplia gama de condiciones de enfermedad^1,4.

Sin embargo, en comparación con modelos de roedores, se limita el número de animales de un modelo de cerdo respectivo que puede prestarse para experimentos en cualquier momento. Esto es debido al intervalo de generación porcina de aproximadamente un año y los esfuerzos financieros y tiempo necesarios para la generación de modelos porcinos y cría de animales. Por lo tanto, los individuos de un modelo porcino, así como las muestras que se pueden generar de estos cerdos, son muy valiosos, especialmente si genéticamente modelos porcinos o cuestiones experimentales a largo plazo (por ejemplo, las complicaciones tardías de enfermedades crónicas) se examinan en individuos de^2,6,7.

En el curso de cualquier estudio, realización de análisis adicionales que no había sido previsto en el diseño experimental inicial del estudio puede más tarde resultan para ser relevantes, por ejemplo, distintas preguntas que surgen de previamente descubiertos por dirección resultados inesperados. Si las muestras adecuadas para tales experimentos adicionales no están disponibles, desproporcionadamente elevado costo y gastos de tiempo podrían ser necesarios generar cerdos adicionales y muestras de tejido. Para estar preparado para tales eventualidades, generación de colecciones de Biobanco de conservado muestras de respaldo de diferentes órganos, tejidos o bio-líquidos, cuantitativa y cualitativamente adecuados para una amplia gama de análisis posteriores, se considera un importante enfoque^2,6,7. Derivando beneficios óptima de un modelo animal porcino, la disponibilidad de muestras adecuada Biobanco también ofrece la posibilidad única para efectuar un amplio espectro de métodos de análisis diferentes sobre los materiales idénticos a nivel de órganos múltiples en la misma cada animal, por ejemplo, por la distribución de las muestras a los científicos de diferentes grupos de trabajo organizados en una red de investigación^2,6,7. Además, la estrategia de muestreo ” progresista ” en biobancos también contribuye a una reducción del número de animales necesarios en un estudio. Las ventajas del modelo porcino biobancos han demostrado recientemente en un órgano múltiple, multiomics estudio, examen de órganos diafonía en un modelo porcino genéticamente modificado de la diabetes a largo plazo, utilizando muestras del Biobanco cerdo Munich MIDY ².

Hay algunos requisitos obligatorios Biobanco de muestras generalmente deben cumplir para establecer la fiabilidad y la interpretabilidad de los resultados de los análisis realizados posteriormente. Las muestras deben generarse reproducible, y deben ser adecuadamente representante, es decir, que reflejan las características morfológicas y moleculares interesadas del tejido/órgano las muestras fueron tomadas de⁷. Para ser conveniente para una amplia gama de tipos de análisis posteriores, las muestras deberán tomadas en cantidades suficientes y procesadas según las demandas (incluyendo las condiciones de tiempo y temperatura) de los diferentes métodos analíticos, incluyendo descriptivo Análisis histopatológicos, como cryohistology, parafina plástico histología, inmunohistoquímica, hibridación en situ , análisis microscópico ultraestructural de electrón y diagnóstico análisis de laboratorio clínico, así como moleculares Análisis de DNA, RNA, proteínas y metabolitos.

Para permitir la evaluación de una amplia gama de distintos parámetros morfológicos cuantitativos tales como números, volúmenes, longitudes o superficies de las estructuras tisulares distintos análisis estereológicos cuantitativa, planos de sección al azar de la las muestras histológicas de los respectivos órganos/tejidos necesitan ser preparado^7,8,9,10,11. En estudios morfológicos cuantitativos, la determinación precisa del volumen total del tejido, órgano o compartimiento del órgano, las muestras fueron tomadas de (es decir, el espacio de referencia) es de crucial importancia^{7,9 , 12} para calcular las cantidades absolutas de los parámetros de interés en el respectivo órgano, tejido u organismo. Finalmente, el efecto de la contracción relacionada con la inclusión del tejido durante la preparación de secciones histológicas tiene que ser determinada y tener en cuenta¹³. Por lo tanto, cuantitativos análisis estereológicos, especialmente de muestras archivadas (fijada bloques de tejido embebido, cortes histológicos, las muestras de tejido, etc.) de los estudios anteriores son a veces severamente limitada o incluso imposible¹², particularmente si la volumetría de los respectivos órganos/tejidos no se realizó, si no hay diseños de muestreo adecuado se aplicaron para garantizar muestras representativas, si los números y cantidades de muestras individuales disponibles no son suficientes, o si el procesamiento de la muestras es incompatible con la estimación de los parámetros morfológicos cuantitativos de interés. Debido a los múltiples posibles factores que influyen en la adecuación de los materiales de archivo-muestra para los análisis de distintos parámetros morfológicos cuantitativos inequívocamente no puede ser respondida, pero depende de la cuidadosa evaluación de cada caso individual.

Así, como la ubicación, tamaño, número, proceso, dirección de ajuste y orientación de muestras potencialmente afectarán los resultados de los análisis posteriores, estos factores son de gran importancia y deben ser considerados en el diseño experimental de cualquier estudio. En cuanto a estos aspectos y las particularidades de la anatomía porcina, directrices de muestreo completa, detallada, a gran escala recientemente se han establecido modelos animales adaptados al porcino, proporcionando una sólida referencia estandarizados, reproducibles y la eficiente generación de muestras redundantes, adecuadamente procesadas, alta calidad de más de 50 diferentes porcino órganos y tejidos^6,7.

Las descripciones metodológicas y el video tutorial se muestra en el presente artículo proporcionan detallada, ilustrativo, comprensible, instrucciones paso a paso para el funcionamiento práctico de una variedad de técnicas de volumetría, toma de muestras de tejidos porcinos y órganos y procesamiento de las muestras de tejido para métodos de diferente análisis aguas abajo. Las técnicas recomendadas incluyen métodos para determinación de densidades basadas en los principios de Arquímedes y Cavalieri⁹y volúmenes de órganos y tejidos, incluyendo la determinación de las dimensiones de la contracción tridimensional de tejidos relacionados con la incrustación en diferentes inclusión media¹⁴ durante el proceso de la examinación histológica, acerca de la aplicación del muestreo aleatorio sistemático ponderado de volumen posible, procesamiento de muestras de tejido muestreado para diferentes posterior Análisis^7,8,9,15y generación de apropiadamente orientan y procesaron muestras para posibles análisis estereológicos cuantitativa^{7,8, 9,10,11}. Junto a su aplicación en proyectos de Biobanco porcino, los métodos demostrados son generalmente apropiados para examinar propiedades cuantitativas histo-morfológico de órganos/tejidos todos los estudios. Además, diseños de muestreo al azar sistemático son particularmente beneficios para la generación de muestras representativas en experimentos utilizando métodos de análisis molecular para detectar alteraciones de la abundancia de, por ejemplo, ARN, proteínas o metabolitos en distintos órganos y tejidos.

Los párrafos siguientes proporcionan una breve introducción a estos métodos, mientras que su rendimiento práctico se describe en la sección de protocolo.

Determinación de volúmenes de órganos y tejidos
Determinación de volúmenes y pesos de órganos es importante en varios parámetros experimentales, como estos factores podrían indicar cambios, potencialmente relacionados a experimentalmente examinan factores de interés. El volumen total de un órgano, tejido también es necesaria para calcular parámetros cuantitativos absolutos (por ejemplo, el número total de células), de densidades de volumen stereologically Estimado numérico(es decir, el número de células por unidad de volumen del tejido)^7,12. Aparte de técnicas de uso de equipo técnico complejo, tales como tomography de la computadora, hay básicamente tres métodos prácticos utilizados para determinar el volumen absoluto de un órgano o tejido. El volumen de un órgano puede determinarse “volumétrica medida directa” según el principio de Arquímedes, es decir, medición del volumen de agua o solución salina desplazados por la estructura cuando completamente sumergida. Sin embargo, de órganos porcinos comparable grandes, estos enfoques son imprácticos y propensas a la imprecisión, ya que requieren matraces volumétricos/medición muy grande. Más convenientemente, se puede calcular el volumen de un órgano/tejido de su peso y densidad^7,12,16, que eficientemente puede ser determinado mediante el «método de inmersión»^{7,12 ,16} (paso protocolo 1.1.). Volúmenes de órganos y tejidos se pueden calcular también mediante volumetría enfoques basados en el “principio de Cavalieri” (1598-1647). En términos simples, se establece el principio de Cavalieri, que si dos objetos son seccionados en planos paralelos a un plano de tierra, y los perfiles de las secciones de cortan a través de los dos objetos en la correspondiente Distancias desde el plano de tierra tienen las mismas áreas, los dos objetos tienen el mismo volumen. Así, el volumen de los objetos forma arbitrariamente puede estimarse como el producto de sus áreas de Perfil de sección en planos paralelos, igualmente distante de la sección y la distancia entre los planos de sección. Esto es comprensible con la siguiente analogía: considere dos pilas que consiste en el mismo número de monedas idénticas se colocan lado a lado, una pila con la ordenada de monedas apilado uno encima del otro dando forma cilíndrica de la pila de monedas y el otro pila de monedas con el centro coloca monedas (Figura 3A). Aunque las formas de las dos pilas de moneda son diferentes, sus volúmenes son los mismos, desde las áreas de las monedas en los niveles correspondientes de ambas pilas (es decir, las áreas de los perfiles de secciones paralelas de cortan a través de dos pilas de moneda en distancias iguales desde el de tierra) son idénticos. Estimación de los volúmenes de órganos porcinos y tejidos utilizando el principio de Cavalieri^7,12,15 se describe en el paso 1.2.

Determinación del grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión histológica
En el análisis de varios parámetros morfológicos cuantitativos medidos en las secciones histológicas del tejido, el efecto de la contracción relacionada con la inclusión del tejido que ocurre durante el proceso de la histología del tejido debe ser determinado y tomado en cuenta. El grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión puede ser variable y depende tanto en el tejido, su procesamiento y el medio empotrar^{8,13,17,18,19}. Generalmente, se producen cambios relacionados con la inclusión del volumen de una muestra de tejido (es decir, principalmente la contracción) en las tres dimensiones del espacio y, por tanto, afecta a todos los parámetros dimensionales estimados por análisis cuantitativos estereológicos⁸ . Básicamente, se puede estimar el grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión, expresado como el factor de contracción de tejido lineal (f_S), como se muestra en el paso 1.3. y se utiliza para la corrección de parámetros morfológicos cuantitativos (sensible a la contracción)¹⁴.

Muestreo aleatorio sistemático ponderado por el volumen de órganos/tejidos
Para el establecimiento de una colección de Biobanco de muestras de órganos y tejidos porcinos, enfoques de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen como se describe en el paso 2 han demostrado para ser técnicas prácticas, ahorro de tiempo y eficientes para la generación de representante, tejido de usos múltiples muestras^7,8,9,15.

Generación de secciones isotrópico aleatorio uniforme y Vertical uniforme aleatoria secciones para cuantitativos análisis estereológicos
Las muestras de tejido de Biobanco deben ser conveniente para una amplia variedad de métodos diferentes análisis estereológicos cuantitativa para la estimación de un máximo de parámetros que no se pudo determinar sin una muestra adecuadamente preparada. Casi todos los parámetros estereológicos cuantitativos pueden determinarse, utilizando «isotrópico (independiente) uniforme aleatorio (IUR) las secciones»^8,9. En las secciones IUR, la orientación tridimensional del plano de sección de la muestra de tejido es al azar. Esto puede lograrse por asignación al azar de la posición de la muestra de tejido en relación con la posición del plano de sección, como se aplica en el método de “Isector”¹¹ (paso 3.1 del Protocolo), o por asignación al azar de la orientación del plano de sección relativa a la muestra de tejido, como en el método de “Orientadores”¹⁰ (paso 3.2 del Protocolo). En muestras de tejido, como piel o mucosa muestra mostrar un eje vertical presente de forma natural, o definido y bien identificable, preparación de “uniforme aleatorio (VUR) las secciones verticales” (paso de protocolo 3.3.) estrictamente seccionado en el plano de su eje vertical es ventajoso^8,20. Para un discurso completo de los fundamentos teóricos del muestreo de IUR/VUR y una discusión amplia de posibles análisis estereológicos cuantitativas aguas abajo, el lector interesado se refiere a los libros de texto de estereología cuantitativa en la vida Ciencias^8,9.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí utilizan muestras de tejidos derivadas animales muertos y cumplen con las regulaciones legales alemanas del bienestar animal. 1. volumetría Técnica de inmersión para la determinación de densidades de tejido/órgano (figura 1 y figura 2) 7 , 12 , 16…

Representative Results

Técnica de inmersión para la determinación de la densidad del tejido/órgano Figura 12A -B muestra la representación determinación de la densidad y el volumen de un riñón porcino utilizando la técnica de inmersión que se describe en el paso 1.1 (figura 1, figura 2). Resultados más representativos de las mediciones de…

Discussion

Generación de colecciones de muestras Biobanco de modelos animales porcinos requiere técnicas robustas y protocolos para la determinación de volúmenes de órganos y tejidos, la generación reproducible de representante, las muestras de tejido redundante apto para una amplia gama de métodos de análisis diferentes y por la aleatorización de la orientación de las secciones de la muestra para los análisis cuantitativos de estereológicos. Los métodos descritos en el presente artículo se adaptan a los tamaños de p…

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.