Utarbeidelse av Murine Submandibular Salivary kjortelen for stående Intravital mikroskopi
Summary
Vi beskriver en protokoll for å kirurgisk avsløre og stabilisere det murine submandibular salivary kjortelen intravital bildevisning oppreist intravital mikroskopi. Denne protokollen er lett tilpasses andre exocrine kjertler av hodet og nakken regionen av mus og annet liten Red.
Abstract
Det submandibular salivary kjortelen (SMG) er en av tre store spyttkjertler, og er av interesse for mange ulike felt av biologisk forskning, inkludert cellebiologi, onkologi, odontologi og immunologi. SMG er en exocrine kjertel består av sekretoriske epitelceller, myofibroblasts, endotelceller, nerver og ekstracellulær matrix. Dynamisk cellulære prosesser i rotte og mus SMG har tidligere blitt avbildet, hovedsakelig ved hjelp av invertert multi Foton mikroskop systemer. Her beskriver vi en enkel protokoll kirurgiske og stabilisering av murine SMG i bedøvet mus for i vivo bildebehandling med oppreist multi Foton mikroskop systemer. Vi presenterer representant intravital image sett av endogene og overført adoptively fluorescerende cellene, inkludert merkingen av blodkar eller salivary kanaler og andre harmonisk generasjon å visualisere fibrillar kollagen. I sum tillater våre protokollen kirurgisk utarbeidelse av musen spyttkjertler i oppreist mikroskopi systemer, som er brukt for intravital imaging i immunologi.
Introduction
Spytt er skilt ut av exocrine kjertler å smøre mat, beskytte mucosal overflater i muntlig tarmkanalen, og å levere fordøyelsesenzymer samt antimikrobielle stoffer1,2. I tillegg til mindre spyttkjertler ispedd i den muntlige submucosa, finnes det tre bilaterale sett store kjertler som Parodisk, sublinguale og submandibular, i henhold til deres plassering1,2. Pyramideformede epitelceller, organisert i kolbe-formet sacs (acini) eller demilunes som er omgitt av myoepithelial celler og en kjeller membran, skiller serous og slimete komponentene i spytt1. Smale luminal løpet av de acini ut i under Sommer kanaler, som samle inn striated kanaler før de endelig blir med i en enkelt excretory rør1. Den viktigste excretory duct av SMG kalles Wharton’s duct (WD) og åpner i sublinguale caruncle3,4. SMG epithelial batterirommet representerer derfor en svært arborized med mangfoldige terminal endepunkt, ligner en bunt av druer1,5,6. Den SMG interstitium består av blod og lymphatic fartøyer i bindevev7 inneholder parasympatiske nerver8 og ekstracellulær matrix5. Normale menneskelige og gnager spyttkjertler også inneholde T celler, makrofager og dendrittiske celler9, så vel som plasma celler det avsondre immunglobulin en (IgA) i spytt9,10. På grunn av mangefasettert funksjoner i helse og sykdom er SMG et tema av interesse for mange felt av biologisk forskning, inkludert odontologi4, immunologi11, onkologi12, fysiologi8og cellebiologi 3.
Avbildning av dynamisk cellulære prosesser og -samhandlinger er et kraftig verktøy i biologiske13,14. Utviklingen av dype vev bildebehandling og innovasjoner inmicroscopes basert på ikke-lineær optikk (NLO), som bruker spredning eller absorpsjon av flere fotoner av utvalget, har tillatt direkte undersøke mobilnettet prosesser i komplekse vev13 ,15. Absorpsjon av flere fotoner innebærer levering av totale eksitasjon energi ved lav energi fotoner, hvilke rammen fluorophore eksitasjon til fokalplanet og dermed lar dypere vev gjennomtrenging med redusert photodamage og støy fra ut av fokus eksitasjon13,15. Dette prinsippet er ansatt av to-fotonet mikroskopi (2 PM) og tillater bildebehandling av fluorescerende i dypet av opptil 1 mm15,16. Mens kommersielt tilgjengelig 2 PM oppsett har blitt brukervennlig og pålitelig, er den store utfordringen for intravital avbildning nøye avsløre og stabilisere målet orgelet bedøvet mus, spesielt for avbilding av tid forfalle serien. Flere metoder for digital drift korreksjon etter datainnsamling har blitt publisert17,18 og vi nylig utviklet “VivoFollow”, en automatisert rettelsen system, som motvirker langsom vev drift i sanntid ved hjelp av en datastyrt scenen19. Imidlertid er det fortsatt avgjørende for høykvalitets tenkelig for å minimere vev bevegelse, spesielt raske bevegelser forårsaket av pusting eller hjerteslag19. Forberedelse og stabilisering er publisert for flere organer, inkludert ryggmarg20, lever21, hud22, lunge23og lymfeknute24. Videre modeller for rotte salivary kjortelen imaging er utviklet3,25 og videre raffinert ved høy oppløsning intravital avbildning av murint SMG tilpasset en invertert mikroskop installasjonsprogrammet26, 27 , 28.
Her presenterer vi en praktisk og tilpasningsdyktig protokoll for intravital avbildning av murine SMG bruke oppreist lineære mikroskopi, som er vanlig for intravital imaging i immunologi. Dette endret vi en viden ansatt immobilisering scenen brukes for femoral lymfeknute preparater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen gir en enkel tilnærming ved i vivo avbildning av murine submandibular og sublinguale spyttkjertler bruke oppreist ulineær mikroskopi ofte brukt i immunologi. Metoden kan tilpasses for avbilding av andre exocrine kjertler i hodet og nakken. For eksempel, har vår lab utført bildebehandling av lacrimal kjertel på en tilsvarende måte (ikke vist).
Fjerne connective vev rundt SMG er det mest kritiske trinnet av denne protokollen, siden utilsiktet vev skader kan oppst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Swiss National Foundation (SNF) prosjektet grant 31003A_135649, 31003A_153457 og 31003A_172994 (til JVS) og Leopoldina fellesskap LPDS 2011-16 (til BS). Dette arbeidet benefitted fra optisk oppsett av “Mikroskopi Imaging Center” (MIC) av universitetet i Bern.
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
References
- Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , 101-121 (2005).
- Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , 45-60 (2012).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
- Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).
- Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).
- Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).
- Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).
- Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).
- Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).
- Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
- Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
- Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
- Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
- Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).
- Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).
- Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).
- Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton’s duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
- Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).
- McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).
- Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38 (2), 588-595 (2010).
- Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. , 1-13 (2017).
- Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).
- Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).
- Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).
- Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).
- Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).
- Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).
