Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical
Summary
Descreveremos um protocolo para cirurgicamente expor e estabilizar a glândula salivar submandibular murino para intravital imagem usando microscopia intravital vertical. Este protocolo é facilmente adaptável a outras glândulas exócrinas da cabeça e região do pescoço dos ratos e outros pequenos roedores.
Abstract
Glândula salivar submandibular (SMG) é uma das três principais glândulas salivares e é de interesse para muitos diferentes campos de pesquisa biológica, incluindo Imunologia, oncologia, odontologia e biologia celular. O SMG é uma glândula exócrina composta de células epiteliais secretoras, miofibroblastos, células endoteliais, nervos e matriz extracelular. Processos celulares dinâmicos no rato e rato SMG anteriormente tem sido fotografados, principalmente utilizando invertido sistemas multi fóton microscópio. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a preparação cirúrgica e estabilização da SMG murino em ratos anestesiados para a imagem latente na vivo com sistemas vertical multi fóton microscópio. Apresentamos a moda imagem intravital representativa de endógena e enviaram transferido células fluorescentes, incluindo a rotulagem dos vasos sanguíneos ou dutos salivares e geração segundo harmônica Visualizar fibrillar colágeno. Em suma, nosso protocolo permite a preparação cirúrgica das glândulas salivares de rato em sistemas de microscopia na posição vertical, que são comumente usados para intravital imagem no campo da imunologia.
Introduction
Saliva é secretada pelas glândulas exócrinas para lubrificar o alimento, proteger as superfícies mucosas do trato oral e entregar as enzimas digestivas, bem como substâncias antimicrobianas1,2. Além de glândulas salivares menores intercaladas na submucosa oral, existem três conjuntos bilaterais das glândulas maiores identificados como parótida, sublingual e submandibular, de acordo com sua localização1,2. Células epiteliais em forma de pirâmide, organizados em sacos em forma de balão (ácinos) ou demilunes que são circundadas por células mioepiteliais e uma membrana basal, secretam os componentes seroso e mucosos de saliva1. O estreito espaço luminal dos ácinos drenos para dutos intercalados, que se unem para dutos estriados até que eles finalmente se juntam em um único Ducto excretor1. O Ducto excretor principal da SMG é chamado ducto de Wharton (WD) e abre para a carúncula sublingual3,4. O compartimento de epiteliais SMG representa, portanto, uma estrutura altamente arborized com múltiplos pontos de extremidade do terminais, assemelhando-se a um pacote de uvas1,5,6. O interstício SMG é composto de vasos sanguínea e linfática, incorporados no tecido conjuntivo7 que contém nervos parassimpáticos8 e matriz extracelular5. Glândulas salivares normais de humanas e roedores também contêm células T, macrófagos e células dendríticas9, bem como plasmócitos que secretam a imunoglobulina A (IgA) na saliva9,10. Devido a suas funções multifacetadas na saúde e na doença, a SMG é um assunto de interesse para muitos campos de pesquisa biológica, incluindo Odontologia4Imunologia11, oncologia12, fisiologia8e biologia celular 3.
Imagem de interações e processos celulares dinâmicos é uma ferramenta poderosa em pesquisas biológicas13,14. O desenvolvimento do tecido profundo imaging e inovações inmicroscopes baseado em óptica não-linear (NLO), que contam com dispersão ou absorção de múltiplos fótons pela amostra, permitiu-se diretamente, examinar processos celulares em tecidos complexos13 ,15. Absorção de múltiplos fótons envolve a entrega da energia total excitação por fótons de baixa energia, que excitação de fluoróforo limites para o plano focal e, portanto, permite a penetração mais profunda do tecido com Fotodano reduzido e ruído fora do foco excitação de13,15. Este princípio é empregado pela microscopia de dois fotões (14:00) e permite que para a imagem latente de amostras fluorescentes em profundidades de até 1 mm15,16. Enquanto comercialmente disponível 14:00 configurações tornaram-se amigável e confiável, o grande desafio para a imagem latente intravital é cuidadosamente expor e estabilizar o órgão-alvo de ratos anestesiados, especialmente para a imagem latente da série de lapso de tempo. Vários métodos para a correção de deriva digital depois de aquisição de dados ter sido publicado17,18 anos e recentemente desenvolvemos a “VivoFollow”, um sistema de correção automática, que neutraliza o tecido lenta deriva em tempo real usando um estágio informatizado19. No entanto, é ainda essencial para alta qualidade de imagem para minimizar o movimento do tecido, especialmente movimentos rápidos causados pela respiração ou batimento cardíaco19. Procedimentos de preparação e estabilização foram publicados por vários órgãos, incluindo medula espinhal2021de fígado, pele22, pulmão23e linfonodo24. Além disso, modelos para a imagem latente de glândulas salivares de ratos foram desenvolvidos3,25 e ainda mais refinado para intravital imagem de alta resolução do murino que SMG adaptado a um microscópio invertido configuração26, 27 , 28.
Aqui, apresentamos um protocolo prático e adaptável para intravital imagem da SMG murino utilizando microscopia não linear vertical, que é comumente usada para a imagem latente intravital no campo da imunologia. Para este fim, nós modificamos um palco de imobilização muito utilizado usado para preparações de linfonodo poplíteo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo oferece uma abordagem simples para a imagem latente na vivo de murino glândulas salivares submandibulares e sublingual usando microscopia não-linear vertical, muitas vezes usada no campo da imunologia. O método pode ser adaptado para o tratamento de imagens de outras glândulas exócrinas na região da cabeça e pescoço. Por exemplo, nosso laboratório tem realizado de imagem da glândula lacrimal de forma análoga (não mostrada).
Remover o tecido conectivo ao redo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional Suíço (SNF) projeto concessão 31003A_135649, 31003A_153457 e 31003A_172994 (para joint ventures) e Leopoldina companheirismo semi-submersíveis 2011-16 (a BS). Este trabalho beneficiado ópticas configurações do “Microscopia Imaging Center” (MIC) da Universidade de Berna.
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
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