Beredning av murina Submandibular spottkörteln för upprätt Intravital mikroskopi
Summary
Vi beskriver ett protokoll för att kirurgiskt exponera och stabilisera den murina submandibular spottkörteln vid intravital bildåtergivning med upprätt intravital mikroskopi. Detta protokoll är lätt att anpassa till andra exokrina körtlar av huvudet och halsen regionen av möss och andra små gnagare.
Abstract
Den submandibular spottkörteln (SMG) är en av tre stora spottkörtlarna, och är av intresse för många olika fält av biologisk forskning, inklusive cellbiologi, onkologi, tandvård och immunologi. SMG är en exokrin körtel består av sekretoriska epitelceller, myofibroblaster, endotelceller, nerver och extracellulära matrix. Dynamiska cellulära processer hos råtta och mus SMG har tidigare varit avbildas, mestadels med hjälp av inverterad multi photon Mikroskop system. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för kirurgisk beredning och stabilisering av murina SMG hos sövda möss för i vivo imaging med upprätt multi photon Mikroskop system. Vi presenterar representativ intravital bild uppsättningar av endogena och överförs adoptively fluorescerande celler, inklusive märkning av blodkärl eller saliv kanaler och andra harmoniska generation att visualisera fibrillar kollagen. Sammanfattningsvis möjliggör våra protokoll kirurgisk beredning av mus spottkörtlar i upprätt mikroskopi system som vanligen används för intravital imaging i immunologi.
Introduction
Saliv utsöndras av exokrina körtlar att smörja mat, skydda slemhinnorna av muntliga tarmkanalen, och till leverera matsmältningsenzymer samt antimikrobiella ämnen1,2. Förutom mindre spottkörtlarna som interspersed i muntliga submucosa, finns det tre bilaterala uppsättningar av stora körtlar identifierats som parotis, sublinguala och submandibular, enligt deras läge1,2. Pyramidformade epitelceller, organiserade i kolv-formade säckar (acini) eller demilunes som omges av myoepithelial celler och en basalmembranet, utsöndrar de serösa och slemhinnor komponenterna i saliv1. Smala luminala loppet av acini avloppet till ortodoxas kanaler, som förenas i tvärstrimmig kanaler tills de slutligen går med i en enda utsöndringsorganen kanal1. De viktigaste utsöndringsorganen kanalen av SMG kallas Wharton’s duct (WD) och öppnar till den sublinguala karbunkel3,4. SMG epitelial facket utgör därför en mycket arborized struktur med grenrör terminal slutpunkter, som liknar en bunt av druvor1,5,6. Den SMG interstitium består av blodet och fartyg inbäddade i bindväv7 innehåller parasympatiska nerver8 och extracellulär matrix5. Normal människa och gnagare saliv-körtlar innehåller också T-celler, makrofager och dendritiska celler9, samt plasma celler som utsöndrar immunglobulin A (IgA) i saliv9,10. På grund av dess mångsidiga funktioner i hälsa och sjukdom är SMG ett ämne av intresse för många fält av biologisk forskning, inklusive tandvård4, immunologi11, onkologi12, fysiologi8och cellbiologi 3.
Avbildning av dynamiska cellulära processer och interaktioner är ett kraftfullt verktyg i biologisk forskning13,14. Utvecklingen av djup vävnad imaging och innovationer inmicroscopes baserat på ickelinjär optik (NLO), som förlitar sig på spridning eller flera fotoner absorberas av provet, är tillåtet att direkt undersöka cellulära processer i komplexa vävnader13 ,15. Absorptionen av flera fotoner innebär leverans av den totala exciteringsenergi av låg energi fotoner, som inskränker fluorophore magnetiseringen till fokalplanet och därmed tillåter djupare vävnad penetration med reducerad photodamage och buller från av fokus magnetiseringen13,15. Denna princip är anställd av 2-foton mikroskopi (2 PM) och möjliggör avbildning av fluorescerande prover i djup upp till 1 mm15,16. Samtidigt kommersiellt tillgängliga 2 PM uppställningar har blivit användarvänliga och driftsäkra, är den stora utmaningen för intravital imaging att noggrant exponera och stabilisera målorganet sövda möss, speciellt för avbildning av time lapse-serien. Flera metoder för digital drift korrigering efter datainsamling har varit publicerad17,18 och vi nyligen utvecklat ”VivoFollow”, ett korrigeringssystem för automatisk, vilket motverkar långsam vävnad drift i realtid med en datoriserade etapp19. Det är dock fortfarande kritiskt för högkvalitativa imaging för att minimera vävnad rörelse, särskilt snabba rörelser orsakas av andning eller hjärtslag19. Förberedelse och stabilisering förfaranden har publicerats för flera organ, inklusive ryggmärgen20, lever21, hud22, lung23och lymfkörtel24. Dessutom har modeller för råtta spottkörtel imaging utvecklat3,25 och förfinas ytterligare för högupplösta intravital avbildning av det murint SMG skräddarsys en inverterade mikroskopet setup26, 27 , 28.
Här presenterar vi ett praktisk och anpassningsbar protokoll för intravital avbildning av murina SMG med upprätt ickelinjära mikroskopi, som vanligtvis används för intravital imaging i immunologi. I detta syfte ändrade vi ett allmänt sysselsatta immobilisering skede används för Poplietallymfknutor lymfkörtel preparat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll erbjuder en okomplicerad metod för in-vivo imaging av murina submandibular och sublinguala spottkörtlar med upprätt icke-linjära mikroskopi används ofta i immunologi. Metoden kan anpassas för bildtagning av andra exokrina körtlar i regionen huvud och hals. Exempelvis utfört vårt lab avbildning av lacrimal körtel på ett liknande sätt (visas inte).
Ta bort bindväv runt SMG är det mest kritiska steget av detta protokoll, eftersom oavsiktlig vävnadsskada kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av schweiziska nationella stiftelsen (SNF) projektet grant 31003A_135649, 31003A_153457 och 31003A_172994 (till JVS) och Leopoldina gemenskap LPDS 2011-16 (till BS). Detta arbete benefitted från optiska uppställningar i ”mikroskopi Imaging Center” (MIC) vid universitetet i Bern.
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
References
- Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , 101-121 (2005).
- Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , 45-60 (2012).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
- Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).
- Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).
- Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).
- Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).
- Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).
- Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).
- Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
- Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
- Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
- Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
- Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).
- Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).
- Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).
- Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton’s duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
- Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).
- McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).
- Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38 (2), 588-595 (2010).
- Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. , 1-13 (2017).
- Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).
- Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).
- Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).
- Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).
- Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).
- Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).
