בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי
Summary
תקשורת זו מתארת מתודולוגיות בידוד ותרבות של מקרופאגים מכתשי מבני ומודלים מאתר למטרות ניסוי.
Abstract
עיצור מכתשי, מקרופאגים הם מקרופאגים סופני הבדיל, ריאות-תושב ממוצא טרום לידתי. מקרופאגים מכתשי הייחודיות שלהם חיים ארוכים, שלהם תפקיד חשוב פיתוח ריאות ו פונקציה, וכן מותאם לשפות אחרות ריאות התגובות שלהם זיהום ודלקת. נכון להיום, אין שיטה אחידה זיהוי, בידוד של טיפול של מקרופאגים מכתשי מן בני אדם ועכברים קיימת. השיטה יש צורך במחקרים על אלה תאים חיסוניים מולדת חשוב במסגרות שונות ניסיוני. השיטה המתוארת כאן, אשר יכולים לאמץ בקלות על ידי כל מעבדה, היא גישה מפושטת קציר מקרופאגים מכתשי נוזל שטיפה bronchoalveolar או רקמת הריאה, שמירה על אותם בתוך חוץ גופית. מאחר מקרופאגים מכתשי מתרחשים בעיקר בתור תאים חסיד של alveoli, המיקוד של שיטה זו הוא על הם מוציאים אותם לפני הקציר וזיהוי. הריאה הוא איבר מאוד vascularized, סוגי תאים שונים של תאים מיאלואידים ומקור הלימפה המאכלסים, אינטראקציה, והם מושפעים microenvironment הריאה. באמצעות הסט של סמני פני השטח המתואר כאן, חוקרים יכולים בקלות באופן חד משמעי להבדיל מקרופאגים מכתשי לבין אחרים לויקוציטים, לטהר אותם ליישומים במורד הזרם. שיטת תרבות פיתח בזאת תומך אנושיים והן העכבר מקרופאגים מכתשי לצמיחה בתוך חוץ גופית ו תואמת ללימודי תאית ומולקולרית.
Introduction
Microenvironment ריאות הוא מערכת אקולוגית מורכבת באופן ייחודי עם צינור אוויר משוכללים, להערכת. האוויר הנשאף נוסע דרך קנה הנשימה ודרך אינספור ענפי הסמפונות bronchioles לפני שהגיע alveoli, שבו מתרחשת ההחלפה גז דם-אייר. עקב אינטראקציה ישירה עם האווירה, השטח הנשימה מחייבת הגנה מפני השפעות מזיקות של חלקיקים מוטס מזהמים. מספר המחסומים פיזי, כימי, אוטואימונית להגן על הריאות. ראוי לציין, פריסה של phagocytes על פני הנשימה מגישה מערכת ההגנה קו ראשון חשוב. מכתשי מקרופאגים (AMs) הן סוג אחד של phagocytes ריאות תושב, הם מהווים את הרוב המכריע של הבריכה מקרופאג ריאות. כפי שמרמז שמם, AMs המותאמות לשפה בעיקר לומן מכתשי, להתרחש כמו תאים sessile כל הזמן לטעום את האווירה הסביבתית ולתקשר עם האפיתל מכתשי1. מצב יציב בריאות יותר מ 95% של phagocytes בחלל מכתשי הם AMs2, של מי הרכב עשוי לשנות עקב דלקת, זיהום או חשיפה כרונית לחומרים מזהמים.
AMs להשתתף במגוון רחב של פונקציות שעשויות להיות מקומי אל הריאות ו/או חשיבות מערכתית. לדוגמה, AMs חיוניים להתפתחות ולתפקוד מיטבי של הריאות; מעקב המערכת החיסונית; סיווג של פסולת הסלולר, פתוגנים פולשים, בשאיפה חלקיקים3,4,5,6,7. דלדול יישוב של AMs ידוע לפגום סיווג של הנשימה וירוסים, חיידקים4,8. מלבד להיותם phagocytes ולוחמים השורה הראשונה של הומאוסטזיס ריאתי, AMs ידועים לתפקד כתא תאים אנטיגן הצליחו יותר במשיכת T חסינות9, potentiating את היעילות של החיסון תוך-אפי10 ו המשפיעים על מחלת חיסון עצמי בעל הגבלת הריאות אחרי11,השתלת ריאות12. ליקוי בתפקוד AM נקשר proteinosis מכתשי ריאתי (PAP), מצב הנובע מוטציה גנטית, ממאירות או זיהום זה פוגע סיווג פיתחה ריאתי13,14. עכשיו הוא להיות חקר השתלת של AMs כמו גישה טיפולית לטיפול של PAP 15,16.
AMs ידועים מקורם במהלך מופרה, מתעקש הריאות לאורך החיים מבלי להיות מוחלף על ידי במחזור לויקוציטים2,17. אמנם, מחזור AM לגילוי homeostatic בריאות, רמות משתנות של מחזור AM דווחו בתנאים מסוימים קליני כולל זיהום על ידי וירוס שפעת4, הקרנה myeloablative18, חשיפה אנדוטוקסין 19, לגיל20. AMs האמינו לחדש עצמי באמצעות התפשטות בדרגה נמוכה17,21, אך מחקרים אחרונים טוענים כי ומונוציטים יכולים להצמיח אוכלוסיה של הריאה קרישה תוך-כלית מקרופאגים22,23 תחת תנאים ניסיוני, אבל הפונקציונליות של מקרופאגים ריאתי שהומר לאחרונה אלה טרם יוגדר על מחלות ריאה. יתר על כן, הבנת את סף הגירוי בהקשר של הפעלת AM היא אזור שעשוי להיות מעניין, כפי הריאה מנסה לשמור על איזון בין אותות דלקתיים המכונות immunoregulatory.
התיקונים הפיזיולוגיות או פיפטות להוביל לאובדן של ויסות מערכת החיסון חשובים להערכה במסגרות קליניות שונות (למשל, זיהומים בדרכי הנשימה, מחלות ריאה דלקתיות, מחלות ריאה שהותירה). למרות זאת, AMs מזוהים יותר ויותר מחוונים או אפילו גורמים של בריאות ריאתי11,24. כיום, ישנם פרוטוקולים מאוחד לא זמינה עבור קציר, אפיון, ו/או AMs לשמירה על בני אדם, במודלים מאתר פרה. היעדר קונצנזוס על סימנים מקדימים AM ו פנוטיפים ולאחר היעדרות של מתודולוגיה מפורט היה המחסום העיקרי בפיענוח תפקידים בבוקר על ריאות בריאות ומחלה. להלן כללי התנהגות מציע לנו זיהוי ודאי, בידוד, במבחנה אסטרטגיה תרבות מאוד לקדם את ההבנה של התנהגות AM, להקל על מחקרים האבחון והטיפול, ממוקדות AM.
Protocol
Representative Results
Discussion
AMs הם חיים ארוך ריאות תושב מקרופאגים that לאכלס את הריאות החל בלידה, ומתמשך לאורך כל תוחלת החיים26. תפקידיהם פיזיולוגיה ריאתי7 ופתולוגיה12 ו את הפוטנציאל שלהם כדי לנבא מחלת חיסון עצמי ריאתי24 זוהו. כי AMs יש נוכחות ארוכת טווח הריאות11</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים קלייר פרנדרגסט לקבלת סיוע בעריכה את כתב היד. DKN נתמך על ידי מחקר מענק (#2095) של קרן Flinn, TM נתמכת על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים (R01HL056643 ו- R01HL092514). DKN פיתחו את השיטות המחקר תוכנן, כתב היד; אום סייע עם מחקרים שנעשו בבעלי חיים והרכש הדגימה הקלינית; SB סייע עם זרימה cytometric ניתוח ומיון תא; TM ומפוקח המחקרים שנסקרו כתב היד.
Materials
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
