अलगाव और इन विट्रो संस्कृति Murine और मानव वायुकोशीय मैक्रोफेज
Summary
इस संचार के अलगाव और प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए मनुष्यों और murine मॉडल से वायुकोशीय मैक्रोफेज की संस्कृति के लिए तरीके का वर्णन करता है ।
Abstract
वायुकोशीय मैक्रोफेज के जंम के पूर्व मूल के टर्मिनल विभेदित, फेफड़े के निवासी मैक्रोफेज हैं । वायुकोशीय मैक्रोफेज उनके लंबे जीवन में अद्वितीय है और फेफड़ों के विकास और कार्य में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका है, साथ ही साथ अपने फेफड़ों में संक्रमण और सूजन के लिए स्थानीय प्रतिक्रियाओं । तिथि करने के लिए, पहचान, अलगाव, और मनुष्यों और चूहों से वायुकोशीय मैक्रोफेज की हैंडलिंग के लिए कोई एकीकृत विधि मौजूद है । इस तरह के एक विधि विभिंन प्रयोगात्मक सेटिंग्स में इन महत्वपूर्ण जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर अध्ययन के लिए आवश्यक है । विधि यहां वर्णित है, जो आसानी से किसी भी प्रयोगशाला द्वारा अपनाया जा सकता है, bronchoalveolar लेवेज द्रव से या फेफड़े के ऊतकों से कटाई वायुकोशीय मैक्रोफेज के लिए एक सरलीकृत दृष्टिकोण है और उंहें इन विट्रो मेंबनाए रखने । क्योंकि वायुकोशीय मैक्रोफेज मुख्य रूप से alveoli में अनुयाई कोशिकाओं के रूप में होते हैं, इस पद्धति का ध्यान उंहें कटाई और पहचान से पहले विघटित पर है । फेफड़ों एक उच्च संवहनी अंग है, और माइलॉयड और लसीकावत् मूल के विभिन्न सेल प्रकार निवास, बातचीत, और फेफड़ों microenvironment से प्रभावित हैं । सतह मार्करों के सेट का उपयोग करके यहां वर्णित है, शोधकर्ताओं को आसानी से और स्पष्ट रूप से अंय ल्यूकोसाइट्स से वायुकोशीय मैक्रोफेज भेद कर सकते हैं, और उंहें बहाव अनुप्रयोगों के लिए शुद्ध । इस के साथ विकसित संस्कृति विधि दोनों मानव और माउस वायुकोशीय मैक्रोफेज के लिए इन विट्रो विकास में समर्थन करता है, और सेलुलर और आणविक अध्ययन के साथ संगत है ।
Introduction
फेफड़ों microenvironment एक विस्तृत हवा नाली और vasculature के साथ एक विशिष्ट जटिल पारिस्थितिकी तंत्र है । सांस हवा श्वासनली के माध्यम से यात्रा और ब्रांकाई और ब्रांकिओल्स की कई शाखाओं के माध्यम से alveoli, जहां रक्त हवा गैस विनिमय होता है तक पहुंचने से पहले । वातावरण के साथ सीधी बातचीत के कारण, श्वसन सतह हवाई कणों और प्रदूषकों के संभावित हानिकारक प्रभावों से सुरक्षा की आवश्यकता है । शारीरिक, रासायनिक, और immunologic अवरोधों की एक संख्या फेफड़ों की रक्षा । विशेष रूप से, श्वसन सतह पर फ़ैगोसाइट की तैनाती एक महत्वपूर्ण पहली लाइन रक्षा प्रणाली का कार्य करता है । वायुकोशीय मैक्रोफेज (एंस) फेफड़ों के निवासी फ़ैगोसाइट का एक प्रकार हैं, और वे फेफड़ों मैक्रोफेज पूल के विशाल बहुमत बनाते हैं । के रूप में उनके नाम का सुझाव है, एंस के मुख्य रूप से वायुकोशीय लुमेन के लिए स्थानीयकृत रहे है और sessile कोशिकाओं है कि लगातार परिवेश वातावरण नमूना और वायुकोशीय उपकला1के साथ संवाद के रूप में होते हैं । स्थिर राज्य फेफड़ों में, वायुकोशीय अंतरिक्ष में फ़ैगोसाइट के ९५% से अधिक एंस के2, जिनकी संरचना सूजन, संक्रमण, या प्रदूषकों के लिए पुरानी जोखिम के कारण बदल सकते हैं ।
एंस के कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला है कि फेफड़ों के लिए स्थानीय हो सकता है में भाग लेने के लिए और/ उदाहरण के लिए, एंस के विकास में आवश्यक है और फेफड़ों के इष्टतम कार्य; प्रतिरक्षा निगरानी; और सेलुलर मलबे की मंजूरी, रोगजनकों पर हमला, और सांस कणों3,4,5,6,7। एम्स के लक्षित घट श्वसन वायरस और बैक्टीरिया की मंजूरी ख़राब करने के लिए जाना जाता है4,8. फ़ैगोसाइट और फुफ्फुसीय homeostasis के एक पहली लाइन रक्षक के रूप में उनकी भूमिका के अलावा, एंस के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है प्रतिजन-में पेश कोशिकाओं टी सेल उन्मुक्ति9, potentiating intranasal वैक्सीन की प्रभावकारिता10 और फेफड़े प्रत्यारोपण11,12के बाद फेफड़ों प्रतिबंधित उन्मुक्तिकोप्रभावित. AM समारोह में कमी फुफ्फुसीय वायुकोशीय proteinosis (पीएपी), एक आनुवंशिक उत्परिवर्तन, द्रोह या संक्रमण है कि फुफ्फुसीय सर्फेक्टेंट13,14की मंजूरी बाधित से उत्पंन हालत से जोड़ा गया है । एम्स की रोपाई अब पीएपी 15,16के इलाज के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण के तौर पर तलाशी जा रही है ।
एंस के लिए embryogenesis के दौरान उत्पंन और जीवन भर फेफड़ों में ल्यूकोसाइट्स2,17परिसंचारी द्वारा प्रतिस्थापित किया जा रहा बिना बनाए रखने के लिए जाना जाता है । हालांकि, am टर्नओवर समस्थिति फेफड़ों में undetectable है, am टर्नओवर का स्तर अलग इंफ्लूएंजा वायरस4द्वारा संक्रमण सहित कुछ नैदानिक स्थितियों में सूचित किया गया है, myeloablative विकिरण18, endotoxin के लिए जोखिम 19, और वृद्धावस्था20। एंस के एक कम ग्रेड प्रसार17,21के माध्यम से स्वयं को नवीनीकृत माना जाता है, लेकिन कुछ हाल के अध्ययनों का दावा है कि monocytes intravascular फेफड़ों की आबादी को जंम दे सकते है मैक्रोफेज22,23 के तहत प्रयोगात्मक स्थितियों, लेकिन इन नए परिवर्तित फुफ्फुसीय मैक्रोफेज की कार्यक्षमता अभी तक फेफड़ों के रोगों में परिभाषित किया जाना है । इसके अलावा, AM सक्रियकरण के संदर्भ में उत्तेजना की दहलीज को समझना एक संभावित दिलचस्प क्षेत्र है, के रूप में फेफड़ों के लिए भड़काऊ संकेतों और immunoregulatory मशीनरी के बीच एक संतुलन बनाए रखने का प्रयास करता है ।
शारीरिक या रोग परिवर्तन है कि प्रतिरक्षा विनियमन के नुकसान के लिए नेतृत्व के लिए विभिंन नैदानिक सेटिंग्स में मूल्यांकन महत्वपूर्ण है (जैसे, श्वसन संक्रमण, भड़काऊ फेफड़ों के रोग और fibrotic फेफड़ों के रोग) । फिर भी, एम्स तेजी से संकेतक या फेफड़े के स्वास्थ्य के11,24के निर्धारकों के रूप में मांयता प्राप्त कर रहे हैं । वर्तमान में, कोई एकीकृत प्रोटोकॉल संचयन, निस्र्पक, और/या मनुष्यों और नैदानिक murine मॉडल से एंस को बनाए रखने के लिए उपलब्ध हैं । am पुरोगामी और phenotypes पर एक आम सहमति की कमी है, और एक विस्तृत पद्धति के अभाव फुफ्फुसीय स्वास्थ्य और रोग में हूं की भूमिका (ओं) को समझने में प्रमुख अंधी गली गया था । निंनलिखित प्रोटोकॉल एक निश्चित पहचान, अलगाव प्रदान करता है, और इन विट्रो संस्कृति रणनीति है कि बहुत व्यवहार कर रहा हूं की समझ अग्रिम होगा और सुविधाजनक बनाने के नैदानिक और चिकित्सीय अध्ययन लक्षित कर रहा हूं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एंस के लंबे समय से रह रहे है फेफड़े के निवासी मैक्रोफेज है कि जंम के समय फेफड़ों आबाद और पूरे जीवन पर स्थाई26अवधि । फुफ्फुसीय फिजियोलॉजी7 और पैथोलॉजी12 में उनकी भूमिकाओं और फुफ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि संपादन के साथ सहायता के लिए क्लेयर Prendergast धन्यवाद । DKN Flinn फाउंडेशन से एक अनुसंधान अनुदान (#2095) द्वारा समर्थित है और TM स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01HL056643 और R01HL092514) से अनुदान द्वारा समर्थित है । DKN विकसित तरीकों, अध्ययन डिजाइन और पांडुलिपि लिखा था; ओम पशु अध्ययन और नैदानिक नमूना खरीद के साथ सहायता प्रदान की; SB प्रवाह cytometric विश्लेषण और सेल छँटाई के साथ सहायता प्रदान की; टीएम ने पढ़ाई की निगरानी की और पांडुलिपि की समीक्षा की ।
Materials
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
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