현재에 연구, 우리 C924T 유전자 형을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 구성 3 단계: DNA 추출, 연쇄 반응 (PCR), 및 agarose 젤에 제한 조각의 길이 다형성 (RFLP)의 분석에 의해 증폭.
Thromboxane A2 수용 체 (TBXA2R) 유전자 7 막 횡단 영역 G-단백질 결합 superfamily의 구성원입니다. 그것은 atherogenesis 진행, 허 혈, 심근 경색에 관여. 여기 우리는 TBXA2 수용 체 유전자의 3′ 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하기 위해 환자의 유전형의 방법론을 제시. 이 메서드는 전체 혈액에서 C924T 돌연변이 돌연변이 genotypes 제한 다이제스트 분석을 사용 하 여 야생 타입의 식별을 포함 하는 TBXA2 유전자 부분 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 DNA 추출에 의존 구체적으로 제한 조각의 길이 다형성 (RFLP) agarose에 젤. 또한, 결과 TBXA2R 유전자 시퀀싱에 의해 확인 되었다. 이 메서드는 높은 효율과 PCR, 제한 효소 분석에 의해 C924T 다형성의 급속 한 식별 같은 몇 가지 잠재적인 이점을 갖추고 있습니다. 이 방법은 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에 대 한 예측 연구 수 있습니다. 이 방법의 응용 프로그램 atherothrombotic 프로세스, 위험, 아스피린 치료 그룹에서 특정 과목에서에 더 취약 과목을 식별 하는.
TBXA2R 7 막 횡단 영역 널리 표현 되 고 세포 막 또는 세포내 구조1,2에 지역화는 G-단백질 결합 superfamily의 구성원입니다. TBXA2R 신호 통로 고급 동맥 경 화성 프로세스3에 포함 된다. TBXA2 수용 체의 증가 식 atherogenesis 진행 동안 시연 및 임상 이었고 실험 연구 허 혈 및 심근 경색4의 관련 역할을 보여주었다. C924T, TBXA2R 유전자의 단일 염기 다형성 (SNP) 건강 한 지원자에서 기능성 다형성으로 인식 되었다 고 임상 장애5에 연결 되었습니다. 또한 우리의 이전 연구6 시연 TBXA2R 유전자의 C924T 다형성은 사본 안정성;에 관여 특히, 야생 타입 (CC)에 관하여 돌연변이 (TT) 유형 증명서의 증가 불안정성이입니다. 또한, 아데노신 diphosphate (ADP), 피 네 프 린, 다양 한 농도에서 콜라겐 등 여러 자극 유발 돌연변이 유형 (TT)에 대 한 효과적인 더 적은 혈소판. 이것은 감소 된 혈전 형성과 hemostasis 일치 합니다. 따라서, TBXA2R 대 본의 불안정과 관련 된 혈소판 감소 수도 있습니다 연결 될 atherothrombosis와 그것의 합병증 위험이 높은 아스피린 치료 환자6 TBXA2R TT 유전자 형에 대 한 보호 역할 .
여기, 우리는 환자의 유전형 TBXA2 수용 체 유전자의 3′ 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다음 단계에 의존: 전 혈에서 (1) DNA 추출, C924T 돌연변이, 그리고 (3) 야생 타입의 돌연변이 genotypes 제한 조각 길이 사용 하 여 id를 포함 하는 TBXA2R 유전자 부분 (2) PCR 증폭 다형성 (RFLP) agarose 젤에. RFLP 동종 DNA 시퀀스7변화를 이용 하는 기술입니다. 이 응용 프로그램이 검출 DNA 동 질 다 상, 특히 Snp를 찾아서 유전자 변이8생물학 관련성 연결 사용 되었다. 처음으로 인간의 RFLP PCR를 사용 하 여 분석 다형성 ABO 혈액9이었다. RFLP PCR 메서드는 매우 구체적인 금지 endonucleases10를 사용 하 여 DNA 소화 후 다른 길이의 파편의 존재를 평가 하 여 동종 DNA 시퀀스에서 유전자 변이의 분석을 수 있습니다.
지난 몇 년 동안, 다음 방법론 이용 되었습니다 SNP 분석 PCR 기술을 사용 하 여: 짧은 대립 유전자 특정 oligonucleotides11, 대립 유전자 특정 PCR12, DNA microarrays13, 뇌관 연장의 교 잡 oligonucleotide 결 찰14, Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 시간의-비행 (식별 위치 특정 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상15, Taqman 방법16, 추출에 대 한 시퀀싱 직접 DNA 분석 결과 MALDI-TOF) 질량 분석17및 GeneChips18. 이러한 기술을 사용 하 여 간단 하지 않습니다 그리고 비싼 장비를 요구할 수 있습니다. 반대로, PCR RFLP 방법 저렴 한, 사용이 간단, 편리, 높은 효율, 있으며 C924T 다형성의 급속 한 식별 수 있습니다. 또한, 우리15생어 메서드 사용 하 여 TBXA2R 유전자 시퀀싱 하 여 결과를 확인 했다.
이 방법은 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에의 한 예측 연구 수 있습니다. 이 방법을 식별할 수 있는 atherothrombotic 프로세스에 더 취약 과목 특히 높은 위험, 아스피린 치료 환자 가운데 그.
현재 연구에서 우리는 TBXA2R 유전자의 3′ 지역에 위치한 C924T 다형성 (rs4523)의 post-transcriptional 역할을 조사 하기 위해서는 환자의 유전형을 허용 하는 방법을 설명 했습니다. 첫째,이 메서드는 전체 혈액 으로부터 DNA 추출에 의존합니다. 특히,이 첫 번째 과정 이루어져 총 인간 DNA, 게놈 및 미토 콘 드리 아, 신선 또는 냉동, 전체 혈액 샘플에서의 정화 EDTA (구 연산 염 또는 헤 파 린)으로 치료. 전체 혈액 샘플의 단기 저장, 최대 10 일 동안 2-8 ° C에 저장 합니다. 스토리지에 대 한 일 이상,-70 ° c.에 샘플 저장 자동된 정화 과정 4 단계 구성: lyse, 바인딩, 세척, 그리고 elute. 둘째, 방법은 C924T 돌연변이 포함 하는 TBXA2R 유전자 부분의 PCR 증폭에 의존 합니다. 마지막으로, 야생 타입 agarose 젤에 제한 효소 분석 (RFLP)을 사용 하 여 돌연변이 유전자의 식별 수행 됩니다.
중요 한 단계는 프로토콜에는 다음: (i) agarose 젤의 일부에 저장 하는 경우에 RT 사용, 응고 agarose (약 15-20 분 동안 60 ° C)에 끓는 물을 욕조에 다시 녹아 수 또는 렌지 (3-5 분) 따르기 이전에. 참고: 때 다시 agarose 병에 뚜껑을 풉니다. (ii), 또한 때 다시 agarose, 난방 증발 하면 그 농도의 증가. 이러한 이유로, 물 한 작은 볼륨을 추가 하 여 보상에 유용할 수 있었다. (iii) DNA 파편의 미만 1000 bp는 agarose 젤에 의해 분화 되었다와 TBE 버퍼 최상의 가능한 분리를 얻을 것이 좋습니다. (4) 우리 때문에 후자의 준비 더 어렵습니다, 그리고 그것은 설정 하는 데 시간이 더 오래 걸립니다 polyacrylamide 젤 보다는 agarose 젤을 사용 하 여 선호 합니다. (젤 전기 이동 법의 실행 시간 v)는 선택 증폭 제품의 예상된 크기에 의존합니다. 이 프로토콜에 따라, 그것은 20-30 분 2 %agarose 젤에 100 V에서 전기 이동 법을 수행 하기에 충분 한, PCR의 크기 조각 범위 100-500 bp. (vi)에서 10 ~ 50를 필수이 좋은 품질 템플릿 인간의 샘플에서 추출 된 DNA의 ng . 이러한 이유로, 우리는 반자동 또는 수동 한 실행 하는 것이 아니라 자동된 DNA 정화를 사용 하 여 선호 합니다. (vii) PCR 증폭에 대 한 마스터-혼합 반응 및 PCR 제품 소화, 볼륨 (pipetting 동안 액체의 손실에 대 한 계정)에 10% 더 추가 대 한 마스터-믹스 솔루션 필요 볼륨에 대 한 샘플의 수를 곱한 계산 준비 하나의 DNA 샘플에 대 한.
방법의 가장 빈번한 문제는 잘못 된 열 cycler 프로그램, 잘못 된 증폭 마스터-믹스 준비, 또는 DNA 템플릿 오염 추가 증폭 제품의 존재 이다. 게다가, PCR 제품의 부재 비활성된 Taq 중 합 효소 또는 잘못 된 열 cycler 실행 될 수 있습니다. 또한, 예기치 않은 파편의 존재에서 불활성된 효소, 너무 적은 양의 제한 효소 볼륨, 또는 너무 짧은 보육 시간 PCR 제품 오염 또는 불완전 한 소화에 있을 수 있습니다.
지난 몇 년 동안, 다음 방법론 PCR 기법을 사용 하 여 SNP 분석에 대 한 이용 되었습니다: 짧은 대립 유전자 특정 oligonucleotides11, 대립 유전자 특정 PCR12, DNA microarrays13에 뇌관 연장의 교 잡 , oligonucleotide 결 찰14시험, 직접 위치 특정 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상15, Taqman 방법16, 추출 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 식별을 위한 DNA 시퀀싱 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석17, 그리고 GeneChips18. 간단한 사용 및/또는 비싼 장비를 요구 하지 않기 때문에 이러한 방법은 적합 되지 않습니다. 반대로,이 연구에서 설명 하는 PCR RFLP 방법을 저렴 한, 사용이 간단, 편리, 높은 효율, 있으며 C924T 다형성의 급속 한 식별 수 있습니다. 현재 메서드는 제한은 것만 사용할 수 소수 Snp 및 작업 세션에 몇 가지 샘플입니다.
미래의 응용 프로그램에 대 한 TBXA2R C924T 다형성에 대 한 환자 genotypes을 분석 하 여 플 라크 형성과 동맥 경화 진행에 관한 예측 연구를 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 또한,이 메서드는 atherothrombotic 프로세스에 더 취약 과목을 식별할 수 있는, 특히 위험이 높은 환자 아스피린으로 치료. 마지막으로,이 방법은 적절 한 약물 복용량과 개별 약리를 이해 하기 위해 다른 동 질 다 상 특정 약물 (예, 응고 및 경련)에 대 한 맞춤된 의학에 관련 된 연구에 적용할 수 및 치료를 시작 하기 전에 하 고 부작용을 피하기 위해 각 환자에 대 한 임상 응답.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트는 Ateneo Ministero dell’ 사크, S.M., 및 동부에 이탈리아에서에서 부여 하는 60%에 의해 부분적으로 투자 되었다 우리는 또한 의료 학과, 구강 및 바이오 과학, 티 “G. d’Annunzio”의 대학 비용을 연구에 일부 기여를 받았다.
QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM |
PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \ | |
Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
Restriction enzyme 10X buffer | New England biolabs | R0167L | |
Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
Tris base | Sigma | T6066 | |
Boric acid | Sigma | B7901 | |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \ |