Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den Ladungszustand Kaede fluoreszierenden Proteins in endokardialen Zellen der lebenden Zebrafischembryo, die es die Verfolgung von endokardialen Zellen während der ventrikulären Kanal und ventrikulären Herz-Ventil-Entwicklung ermöglicht .
Abstract
In der Embryogenese Zellen durchlaufen dynamische Veränderungen der Zelle Verhalten und Entschlüsselung der zellulären Logik hinter diesen Veränderungen ist ein grundlegendes Ziel auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie. Die Entdeckung und Entwicklung von Photoconvertible Proteinen haben unser Verständnis dieser dynamischen Veränderungen durch die Bereitstellung einer Methode auf, um optisch markieren Sie Zellen und Gewebe unterstützt. Jedoch während Ladungszustand, Time-Lapse-Mikroskopie und anschließende Bildanalyse sich sehr erfolgreich bei der Aufdeckung zelluläre Dynamik in Organe wie das Gehirn oder das Auge als haben, diesen Ansatz dient in der Regel nicht in den Entwicklungsländern Herz Herausforderungen durch die schnelle Bewegung des Herzens während der Diastole. Dieses Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil beschreibt ein Verfahren zur Photoconverting und anschließend tracking endokardialen Zellen (EDZ) im Zebrafisch ventrikulären Kanal (AVC) und ventrikulären Herz-Ventil-Entwicklung. Die Methode beinhaltet zeitlich stoppen das Herz mit einem Medikament in Reihenfolge für genaue Ladungszustand stattfinden. Herzen sind wieder erlaubt schlagen nach dem Entfernen der Drogen- und Embryonalentwicklung wird normal fortgesetzt, bis das Herz wieder für die hochauflösende Darstellung von Photoconverted EDZ einen Zeitpunkt später Entwicklung gestoppt wird. Der zweite Teil des Protokolls beschreibt eine Analysemethode Bild um die Länge einer Photoconverted oder nicht Photoconverted Region in AVC in jungen Embryonen zu quantifizieren, indem Sie das Fluoreszenzsignal aus der dreidimensionalen Struktur auf eine zweidimensionale Karte zuordnen . Zusammen, die beiden Teile des Protokolls ermöglicht zu prüfen, die Herkunft und das Verhalten von Zellen, aus denen der Zebrafisch AVC und ventrikulären Herzklappe und können potenziell studierst Mutanten, Morphants oder Embryonen, die mit behandelt wurden beantragt werden Reagenzien, die AVC und/oder Ventil Entwicklung stören.
Introduction
Der Zebrabärbling ist derzeit eines der wichtigsten vertebrate Modelle, Zell- und Entwicklungsbiologie Prozesse in Vivozu studieren. Dies ist vor allem wegen der Zebrabärbling optische Transparenz und Hilfsbereitschaft, Genetik, wodurch es ein leistungsfähiges Modell für die Anwendung von optischen Techniken genetisch codierte Photoresponsive Protein Technologien1. Speziell für die Untersuchung der Entwicklung von Herz, Zebrafisch erhalten genügend Sauerstoff durch Diffusion, so dass auch Mutanten ohne Herzschlag durch die ersten Wochen der Entwicklung, überleben können Analysen über die Auswirkungen von Entwicklungsgenen und verstört bei schönem Durchblutung am Herzen Morphogenese in die meisten Wirbeltiere2nicht möglich.
Die Zebrafisch Herz Röhre wird durch 24 Stunden Post Düngung (hpf) gebildet. Kurz nach ihrer Gründung fängt das Herz Rohr aktiv zu schlagen. Von 36 hpf, eine deutliche Einschnürung trennt das Atrium aus dem Ventrikel. Diese Region der Verengung ist ventrikulären Kanal (AVC) und Zellen in dieser Region Änderung von einem Plattenepithelkarzinom Morphologie zu einem quaderförmigen Morphologie3genannt. Zebrafisch ventrikulären Ventil Morphogenese beginnt etwa 48 h post Düngung. Durch 5 Tage nach Befruchtung, zwei Klappensegel erstrecken sich in der AVC und verhindern den Rückfluss des Blutes aus dem Ventrikel in den Vorhof während der Diastole4. Tracking-Zellen bei AVC und Ventil Bildung ist anspruchsvoll, da die schnellen Schläge des Herzens es schwierig macht, Zellen über traditionelle Zeitraffer Mikroskopie5,6folgen. Dieses Protokoll, adaptiert von Ross Et Al., 20167, beschreibt eine Methode, die Tg (Fli1a:gal4FFUbs, UAS:kaede)8 Zebrafisch transgene Linie, in der das Photoconvertible Protein Kaede in ausgedrückt wird Endothelzellen, einschließlich des Endokards. Die Droge 2,3-Butanedione-2-Monoxime (BDM) wird verwendet, um das Herz zu schlagen, so dass genaue Ladungszustand des EDZ zwischen 36 und 55 hpf und hochauflösende Bildgebung des Photoconverted EDZ an bestimmten Entwicklungszeit stellen vorübergehend zu stoppen. Es hat bisher gezeigt, dass EDZ Photoconverted mit dieser Methode für mindestens fünf Tage nach dem Zeitpunkt der Ladungszustand7unterscheidbar von den Unbekehrten Nachbarn bleiben kann. Dieses Protokoll beschreibt auch eine Methode für die Bildanalyse der Photoconverted EDZ in Embryonen, die jünger als 48 hpf, die erfolgreich verwendet wurde, um Gewebe Bewegungen während AVC Entwicklung (Boselli Et Al., im Druck)9folgen. Wir hoffen, dass die Leser dieses Protokoll nützlich finden würde, für AVC und Ventil Entwicklung in normalen Embryonen und Mutanten, Morphants oder Medikament behandelten Embryonen zu studieren. Lesen Sie für eine allgemeinere Protokoll in Bezug auf Zelle Tracking mit Photoconvertible Proteinen während der Zebrafisch-Entwicklung bitte den Artikel von Lombardo Et Al., 2012-10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Timing der Ladungszustand: Obwohl Kaede bleibt hell ausgedrückt im EDZ sogar bei 96 hpf, ist anzumerken, dass der Embryo wächst, Laser-Licht mehr diffundiert bevor es die AVC, erschweren die engen Ladungszustand der Kaede erreicht. Bei embryonalen Stadien spätestens 55 hpf, Ballonfahren der Ventrikel und Atrium bedeutet auch, dass die violetten Laserstrahl verwendet für Ladungszustand AVC Zellen ohne ersten Durchgang durch die Atrium oder Ventrikel erreichen kann. Dies bedeutet, dass über 55 hpf, um zu Phot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten danken Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli und Basile Gurchenkov für die Hilfe, konstruieren und fertigen die Form, die in diesem Protokoll beschrieben. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Gemeinschaft, ERC CoG N ° 682938, EMBO Young Investigator Program, die ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), FRM (DEQ20140329553) unterstützt Evalve und geleitet durch den Zuschuss ANR-10-LABX-0030-INRT, ein französischer Staatsfonds die Agence Nationale De La Recherche unter dem Rahmen Programm Investissements Avenir beschriftet ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
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