Zebrafish भ्रूण में सेल Photoconversion के द्वारा निंनलिखित Endocardial ऊतक आंदोलनों
Summary
इस प्रोटोकॉल endocardial कोशिकाओं के रहने वाले zebrafish भ्रूण है कि endocardial नहर और अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक दिल वाल्व विकास के दौरान अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक कोशिकाओं की ट्रैकिंग में सक्षम बनाता है की Kaede फ्लोरोसेंट प्रोटीन की photoconversion के लिए एक विधि का वर्णन .
Abstract
embryogenesis के दौरान, कक्ष व्यवहार में गतिशील परिवर्तन से गुजरते हैं, और इन परिवर्तनों के पीछे सेलुलर तर्क का गूढ़ विकास जीवविज्ञान के क्षेत्र में एक मौलिक लक्ष्य है । खोज और photoconvertible प्रोटीन के विकास के काफी एक विधि प्रदान करने के लिए ऑप्टिकली कोशिकाओं और ऊतकों को उजागर द्वारा इन गतिशील परिवर्तन की हमारी समझ सहायता प्राप्त है । हालांकि, जबकि photoconversion, समय चूक माइक्रोस्कोपी, और बाद में छवि विश्लेषण इस तरह के मस्तिष्क या आंख के रूप में अंगों में सेलुलर गतिशीलता को उजागर करने में बहुत सफल साबित कर दिया है, इस दृष्टिकोण के कारण विकासशील दिल में आम तौर पर इस्तेमाल नहीं किया जाता है हृदय चक्र के दौरान दिल की तेजी से आंदोलन से उत्पंन चुनौतियां । इस प्रोटोकॉल में दो भाग होते हैं । पहला भाग photoconverting के लिए एक विधि का वर्णन करता है और बाद में zebrafish अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक नहर (AVC) और अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक हार्ट वाल्व विकास के दौरान endocardial कोशिकाओं (EdCs) पर नज़र रखने । विधि अस्थायी सही photoconversion के लिए जगह लेने के लिए एक दवा के साथ दिल रोक शामिल है. दिल को दवा और भ्रूण के विकास को हटाने पर धड़कन फिर से शुरू की अनुमति है सामांय रूप से जारी है जब तक दिल फिर से photoconverted EdCs के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक बाद में विकास के समय बिंदु पर बंद कर दिया है । प्रोटोकॉल का दूसरा भाग एक छवि विश्लेषण विधि का वर्णन करने के लिए एक photoconverted या गैर photoconverted क्षेत्र के युवा भ्रूण में AVC में तीन आयामी संरचना एक दो आयामी नक्शे पर से फ्लोरोसेंट संकेत मानचित्रण द्वारा की लंबाई यों तो . एक साथ, प्रोटोकॉल के दो भागों एक मूल और कोशिकाओं है कि zebrafish AVC और अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक दिल वाल्व बनाने के व्यवहार की जांच करने के लिए अनुमति देता है, और संभावित म्यूटेंट, morphants, या भ्रूण है कि इलाज किया गया है के साथ अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है AVC और/या वाल्व विकास को बाधित करने वाले एजेंट ।
Introduction
zebrafish वर्तमान में vivo मेंसेलुलर और विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण हड्डीवाला मॉडल में से एक है । यह काफी हद तक आनुवंशिकी के लिए है zebrafish ऑप्टिकल पारदर्शिता और सुविधा के कारण है, जो यह ऑप्टिकल आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग photoresponsive प्रोटीन प्रौद्योगिकियों1शामिल लागू करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बनाता है । हृदय विकास के अध्ययन के लिए विशिष्ट, zebrafish प्रसार के माध्यम से पर्याप्त ऑक्सीजन प्राप्त ऐसी है कि दिल की धड़कन के बिना भी म्यूटेंट विकास के पहले सप्ताह के माध्यम से जीवित रह सकते हैं, विकासात्मक जीन और परेशान के प्रभाव पर अनुमति विश्लेषण सबसे रीढ़2में हृदय morphogenesis पर रक्त का प्रवाह संभव नहीं ।
zebrafish हार्ट ट्यूब 24 घंटे के बाद निषेचन (hpf) द्वारा बनाई गई है । शीघ्र ही इसके गठन के बाद, दिल ट्यूब सक्रिय रूप से धड़कन शुरू होता है । द्वारा ३६ hpf, एक स्पष्ट कसना निलय से atrium अलग करती है । कसना के इस क्षेत्र अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक नहर (AVC) कहा जाता है, और इस क्षेत्र में कोशिकाओं को एक स्क्वैमस आकृति विज्ञान से एक cuboidal आकृतिविज्ञान3 के लिए बदल जाते हैं । ४८ ज पद निषेचन के आसपास Zebrafish अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक वाल्व morphogenesis शुरू होता है । द्वारा 5 दिनों के बाद निषेचन, दो वाल्व पत्रक AVC में विस्तार और निलय से रक्त की पीठ के प्रवाह को रोकने के लिए हृदय चक्र4के दौरान atrium । AVC और वाल्व गठन के दौरान ट्रैकिंग कोशिकाओं को दिल की तेजी से धड़कन के रूप में चुनौतीपूर्ण है यह मुश्किल पारंपरिक समय चूक माइक्रोस्कोपी5,6के माध्यम से कोशिकाओं का पालन करने के लिए बनाता है । इस प्रोटोकॉल, घोड़ा एट अल, २०१६7से अनुकूलित, एक तरीका है कि टीजी (fli1a: gal4FFयूबीएस, यूएएस: kaede)8 zebrafish ट्रांसजेनिक लाइन, जिसमें photoconvertible प्रोटीन kaede में व्यक्त किया जाता है का उपयोग करता है का वर्णन endocardium सहित endothelial कक्ष । दवा 2, 3-butanedione-2-monoxime (BDM) दिल की धड़कन को अस्थायी रूप से बंद करने के लिए प्रयोग किया जाता है, ३६ और ५५ EdCs के बीच hpf के सटीक photoconversion, और विशिष्ट विकासात्मक समय बिंदुओं पर photoconverted EdCs के उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति. यह पहले से दिखाया गया है कि EdCs photoconverted इस विधि का उपयोग कर पांच दिन या उससे अधिक के लिए photoconversion7के समय के बाद अपने को अनकनवर्ट पड़ोसियों से अलग रह सकते हैं । इस प्रोटोकॉल भी एक photoconverted EdCs के ४८ hpf, जो सफलतापूर्वक AVC विकास के दौरान ऊतक आंदोलनों (Boselli एट अल., प्रेस में)9का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है से छोटे भ्रूण में छवि विश्लेषण के लिए इस्तेमाल विधि विवरण । हमें उंमीद है कि पाठकों को इस प्रोटोकॉल सामांय भ्रूण में AVC और वाल्व विकास के अध्ययन के लिए उपयोगी मिल जाए, और म्यूटेंट में, morphants, या दवा का इलाज भ्रूण । zebrafish विकास के दौरान सेल ट्रैकिंग photoconvertible प्रोटीन का उपयोग करने से संबंधित एक और अधिक सामांय प्रोटोकॉल के लिए, कृपया Lombardo एट अल, २०१२10द्वारा लेख देखें ।
Protocol
Representative Results
Discussion
photoconversion के समय: हालांकि Kaede चमकीले ९६ hpf में भी EdCs में व्यक्त रहता है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि के रूप में भ्रूण बढ़ता है, लेजर प्रकाश अधिक फैलाना से पहले यह AVC तक पहुंचता है, photoconversion के सीमित Kaede अधिक कठिन बना ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डिजाइन और मोल्ड इस प्रोटोकॉल में वर्णित करने में मदद करने के लिए ऐनी-लौरे Duchemin, डेनिस Duchemin, Nathalie Faggianelli और तुलसी Gurchenkov शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस कार्य को FRM (DEQ20140329553), ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), EMBO युवा अन्वेषक कार्यक्रम, यूरोपीय समुदाय, ईआरसी दांता N ° 682938 Evalve और अनुदान ANR द्वारा-10-LABX-0030-INRT, एक फ्रांसीसी राज्य निधि द्वारा प्रबंधित द Agence नॅशनल डे ला सभ्य फ्रेम प्रोग्राम अंतर्गत Investissements d’Avenir त्यसपछि ANR-१०-IDEX-0002-02.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
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