Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

요약

이 프로토콜에가 생활의 endocardial 세포에서 형광 단백질의 photoconversion에 대 한 방법을 설명 합니다 zebrafish 태아 것 운하 및 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀의 추적을 가능 하 게 .

초록

Embryogenesis, 동안 셀 셀 행동의 동적 변화를 받아야 하 고 개발 생물학의 분야에서 근본적인 목표는 이러한 변화 뒤에 세포 논리를 해독 합니다. Photoconvertible 단백질의 개발과 발견은 크게 주 었 이러한 동적 변화에 대 한 우리의 이해 광학 세포와 조직을 강조 하는 방법을 제공 하 여. 그러나, 동안 photoconversion, 시간 경과 현미경 및 후속 이미지 분석 뇌 또는 눈 등 장기 잠복 세포 역학에 매우 성공적인 것으로 입증 되었습니다,이 방법은 일반적으로 사용 하지 않습니다로 인해 개발에 심장 주기 동안 심장의 빠른 움직임으로 인 한 과제. 이 프로토콜은 두 부분으로 구성 됩니다. 첫 번째 부분에서는 photoconverting 및 이후 zebrafish 것 운하 (AVC)와 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀 (EdCs)를 추적 하는 방법을 설명 합니다. 방법은 일시적으로 마음 자리를 정확 하 게 photoconversion에서 마약을 중지 포함 한다. 마음 다시 시작할 수 있습니다 약물 및 배아 개발의 제거에 따라 박동 EdCs 발달 시간 나중에 photoconverted의 고해상도 이미징 마음 다시 중지 될 때까지 정상적으로 계속. 프로토콜의 두 번째 부분에 2 차원 지도 3 차원 구조에서 형광 신호를 매핑하여 젊은 배아에서 AVC에서 photoconverted 또는 비 photoconverted 영역의 길이 계량 하는 이미지 분석 방법을 설명 합니다. . 함께, 프로토콜의 두 부분 기원 그리고 zebrafish AVC 및 것 심장 밸브, 구성 하 고 돌연변이, morphants, 또는으로 치료 배아 연구에 대 한 잠재적으로 적용할 수 있습니다. 있는 셀의 동작을 수 AVC 및 밸브 개발을 방해 하는 시 약

서론

Zebrafish는 현재 셀룰러 및 발달 과정에 vivo에서공부 하는 가장 중요 한 척추 모델 중 하나입니다. 이것은 크게 zebrafish의 광학 투명도 그리고 유전학, 그것에 게 유전으로 관련 된 광학 기술을 적용 하기 위한 강력한 모델을 순종 인코딩된 photoresponsive 단백질 기술¹. 특정 심장 개발의 연구, zebrafish 받을 충분 한 산소 보급을 통해 하트 비트 없이 돌연변이 분석을 허용 하는 발달 유전자 교란된 효과에 개발의 첫 번째 주까지 살아남을 수 있는 그런 심장 morphogenesis 대부분 척추 동물²가능 하지에 혈액 흐름.

Zebrafish 심장 관 24 시간 게시물 수정 (hpf)에 의해 형성 된다. 그것의 대형 조금 후에 심장 튜브 적극적으로 치고 시작 합니다. 36에 의해 hpf, 분명 수축 분리는 심 실에서 심. 수축의이 지역에서에서 호출 됩니다 것 운하 (AVC), 그리고이 지역의 변화에 셀 편평 형태학 cuboidal 형태³. Zebrafish 것 밸브 morphogenesis 시작 약 48 h 수정 게시. 5 일에 의해 게시물 수정, 두 개의 밸브 전....

프로토콜

1. 금형을 준비 하 고 장착 agarose

1. 3D 프린터 또는 전통적인 기계 워크숍 도구를 사용 하 여 그림 1 에 표시 된 치수와 금형을 만듭니다.
2. 35 m m 플라스틱 마운트 그릇에 녹 인된 1 %agarose 약 1.5 mL를 플라스틱. 형과 agarose 사이 트랩 공기를 피하기 위해 돌보는 액체 agarose에서 플라스틱 금형을 놓습니다. 4 ° C에서 접시를 놓고는 agarose 견고 (약 5 분이이 소요) 때까지 기다려 다음 플라스틱 몰드를 제거 합니다.
3. 나중에 사용에 대 한 장착 접시를 저장 하는 뚜껑 접시 커버 다음 접시와 뚜껑 parafilm으로 단단히 포장. 장착 요리를 저장할 수 있습니다 다음 뚜껑 면이 아래로 최대 5 일 동안에 4 ° c.
4. 1.5 mL에 0.7% 낮은 융 점 agarose의 1 mL aliquots Eppendorf 관 장착 당일 사용을 사전에 준비 합니다.
   참고: 장착 접시의 agarose 우물 것 이다 변형 시간이 지남에으로 물 증발 parafilm 래핑되지 않은 요리 주위 밀접 하 게 하는 경우.

2.는 Photoconversion에 대 한 배아를 얻기

....

결과

48에서 태아 photoconverted의 예로 hpf 80에서 다시 몇 군데와 hpf 영화 1 , 2, 그림 2에 표시 됩니다. 그들의 차동 색깔을 녹색 또는 그들의 빨간 양식으로 따라야 하는 셀의 동작을 사용 하면 형광등 빨간 형태, 그것의 형광 녹색 양식에서 단백질에서 변환 존중 레스터가 405 nm 빛에 노출 밸브 형성 동안 이웃입니다. 그것은 48 hpf AVC의 몇 photoconverted 셀 나중 확산 및 밸브 전단의 1 개의 측에 나중에 주로 살고 볼 수 있습니다.

그림 3에서 볼 수 photoconverting EdCs 안마당에는 심 실에서 후 36 hpf 배아에 설명 하는 이미지.......

토론

Photoconversion의 타이밍: 비록가 남아 96 에서도 EdCs에 밝게 표현 hpf, 그 태아 성장 함에 따라 레이저 광 확산 더 장난의 한정 된 photoconversion를 더 어렵게 만드는 AVC에 도달 하기 전에 주목 해야 한다. At 배아 단계 55 보다 나중 hpf, 열기구는 심 실 및 아 트리 움의 의미 photoconversion 용 바이올렛 레이저 빔 AVC 셀 심 방 또는 심 실 첫 번째 통과 없이 연결할 수 없습니다. 55 이상 즉 hpf, photoconvert는 AVC의 EdCs 순서로 하나 해야 합니다 또한 photoconvert 추가 EdCs 심 방 및 심 실.

BDM과 tricaine: EdCs의 정확한 photoconversion 심장 박동에서 일시적으로 중지 해야 합니다. BDM (2, 3 butanedione monoxime)는 잘 알려진 심장 근육 수축¹²를 억.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
재료
물고기를 기르고 알을 모으는 데 필요한 장비(자세한 내용은 Zebrafish Book22 참조).
실체현미경
정립 컨포칼 현미경(488nm, 561nm 및 405nm에서 작동하는 레이저, 조정 가능한 다광자 레이저 및 Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 대물렌즈 장착)	Leica	Leica SP8
Heat	block ThermoScientific	88870001
35mm x 10mm 조직 배양 접시	Falcon	353001
6 웰 플레이트	Falcon	353046
Petri 접시
집게
유리 피펫
금형
<강력한>시약
8 mg/mL 트리카인 재고 용액
1 M BDM 원액
UltraPure 저융점 아가로스	Invitrogen	16520-050
아가로스	Lonza	50004
PTU (1-페닐-2-티오우레아)	시그마 Aldrich	P7629
배아 배지: 30x 원액
<강력한>소프트웨어 이미지 분석, 곡선 피팅, 바이오 형식 도구 상자 MathWorks8 mg/mL 트리카인 원액200 mg 트리카인 분말(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설폰산)이 장착된 strong>
	Matlab Sigma-Aldrich	E10521
pH 7로 조정하고 부분 표본을 추출하여 -20°C에서 보관하십시오. 씨
1 M BDM 원액
1 g BDM	Sigma-Aldrich	112135
10 mL ddH2O
부분 표본 및 -20°°C에서 보관 C
Embryo medium: 30x 스톡 용액
50.7 g NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
0.78 g KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7
1.47 g 마그네슘 설페이	Sigma-Aldrich	7487-88-9
2.1g 칼슘 아질산염 사수화물	Sigma-Aldrich	13477-34-4
19.52g HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산)	시그마 알드리치	7365-45-9
pH 7.2로 조정하고 실온
<강>곰팡이< / 강>
PlasCLEAR 수지	에 보관하십시오.아시가
플러스 39  자유형 Pico 3D 프린터	Asiga

25 mL Danieau 트