Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri
Summary
Bu iletişim kuralı Kaede yaşayan endocardial hücreleri floresan proteinin photoconversion için bir yöntemi açıklar endocardial hücreleri izleme Atriyoventriküler kanal ve Atriyoventriküler kalp kapak geliştirme sırasında sağlar Zebra balığı embriyo .
Abstract
Embriyo sırasında hücre hücre davranış dinamik değişiklikleri meydana ve bu değişiklikleri arkasındaki hücresel mantık deşifre gelişim biyolojisi alanında temel bir hedeftir. Büyük ölçüde bulma ve geliştirme photoconvertible proteinlerin anlayışımız bu dinamik değişiklikleri optik hücre ve dokulara vurgulamak için bir yöntemi sağlayarak destekli. Photoconversion, hızlandırılmış mikroskobu ve sonraki görüntü analizi beyin veya göz gibi organlarda ortaya çıkarılması hücre dinamiği içinde çok başarılı olduğu kanıtlanmıştır iken, ancak, bu yaklaşım genellikle nedeniyle gelişen kalp kullanılmaz Kalbin hızlı hareket tarafından kalp döngüsü sırasında yarattığı sorunlar. Bu protokol iki bölümden oluşur. İlk bölümü photoconverting ve endocardial hücreleri (EdCs) Zebra balığı Atriyoventriküler kanal (AVC) ve Atriyoventriküler kalp kapak geliştirme sırasında daha sonra izlemek için bir yöntem açıklanır. Yöntem kalp sırayla gerçekleşmesi doğru photoconversion için bir ilaç ile geçici durdurma içerir. Kalpler devam etmek için izin verilen dayak kaldırmadan ilaç ve embriyonik gelişim devam ediyor normal kalp tekrar photoconverted EdCs daha sonra gelişimsel zamanda noktada yüksek çözünürlükte görüntüleme için durduruluncaya kadar. İkinci protokolünün bir parçası olarak bir iki boyutlu harita üç boyutlu yapısını floresan sinyalini eşleyerek genç embriyo AVC photoconverted veya photoconverted olmayan bir bölgede uzunluğunu ölçmek için bir görüntü analiz yöntemi açıklar . Birlikte, protokol iki bölümden bir Zebra balığı AVC ve Atriyoventriküler kalp kapakçığı oluşturan ve potansiyel olarak mutantlar, morphants veya ile tedavi edilmiş embriyoların eğitimi için uygulanan olabilir hücreleri davranışını ve kökeni incelemek izin verir reaktifler AVC ve/veya Vana geliştirme bozabilir.
Introduction
Zebra balığı şu anda hücresel ve gelişim süreçleri vivo içindeçalışmak için en önemli omurgalı modellerinden biri. Bu büyük ölçüde nedeniyle Zebra balığı’nın optik şeffaflık ve amenability genetik olarak içeren optik teknikleri uygulamak için güçlü bir model yapar genetik photoresponsive protein teknolojileri1kodlanmış. Kalp Geliştirme çalışma özgü, Zebra balığı almak yeterli oksijen Difüzyon yolu ile kalp atışı olmadan hatta mutantlar analizleri gelişimsel genlerin ve perişan etkisi izin geliştirme, ilk hafta boyunca yaşayamaz öyle ki kan akımı üzerinde kalp morfogenez çoğu omurgalılar2‘ mümkün değil.
Zebra balığı kalbini tüp 24 saat sonrası döllenme (hpf) tarafından kuruldu. Kısa bir süre sonra oluşumu, kalbini tüp aktif dayak başlar. 36 tarafından hpf, açık bir daralma ayıran atrium ventrikül üzerinden. Daralma bu bölgesine Atriyoventriküler kanal (AVC) ve bu bölge değişikliği hücrelerinin Skuamöz Morfoloji tetrahedron Morfoloji3denir. Zebra balığı Atriyoventriküler kapak morfogenez başlar yaklaşık 48 h Döllenme sonrası. Tarafından 3 gün Döllenme sonrası, iki kapak Beyannameler AVC genişletmek ve ventrikül kan atrium için geri akışı sırasında kalp döngüsü4önlemek. Hızlı atan kalp hücreleri geleneksel hızlandırılmış mikroskobu5,6takip etmek zor yapar gibi hücreleri AVC ve Vana oluşumu sırasında izleme meydan okuyor. Steed ve ark., 20167, uyarlanmış bu iletişim kuralı, photoconvertible protein Kaede olarak ifade edilir Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 Zebra balığı mutant satýr, bir yöntem açıklar endotel hücreleri, endokard dahil olmak üzere. Uyuşturucu 2,3-butanedione-2-monoxime (BDÖ) yenerek, EdCs 36 55 hpf ve photoconverted EdCs gelişimsel zaman belirli noktalarda yüksek çözünürlüklü görüntüleme arasında doğru photoconversion sağlayan kalp geçici olarak durdurmak için kullanılır. Daha önce bu yöntemi kullanarak EdCs photoconverted beş gün veya daha fazla photoconversion7saat sonra dönüştürülmeyen komşularını ayırt kalabileceği gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı da photoconverted EdCs embriyo 48 genç görüntü analizi için kullanılan bir yöntem detaylar doku hareketleri sırasında AVC geliştirme (Boselli vd., Basında)9takip için başarılı bir şekilde kullanılmıştır hpf. Biz okuyucular bu protokolü yararlı AVC ve Vana geliştirme normal embriyo ve mutantlar, morphants veya uyuşturucu tedavi edilen embriyolar eğitimi için bulacağını umuyoruz. Zebra balığı geliştirme sırasında photoconvertible proteinleri kullanarak hücre izleme ile ilgili daha genel bir protokol için lütfen Lombardo vdtarafından 201210makaleyi görüntüleyin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Photoconversion zamanlaması: her ne kadar Kaede bile 96 EdCs içinde parlak ifade kalır hpf, embriyo büyüdükçe, Kaede kapalı photoconversion daha zor hale AVC ulaşmadan önce lazer ışığı daha fazla yayılır olduğunu belirtmek gerekir. At embriyonik aşamalarında 55’dan sonra hpf, aynı zamanda atrium ve ventrikül Balonculuk anlamına gelir photoconversion için kullanılan Menekşe lazer ışını AVC hücreleri atrium ya da ventrikül üzerinden ilk geçen olmadan ulaşamıyorum. Bu demektir ki…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli ve Basile Gurchenkov tasarım ve bu protokol için açıklanan kalıp yapmak yardımcı olduğunuz için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser desteklenen FRM (DEQ20140329553), (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01) ANR, EMBO genç araştırmacı programı, Avrupa Topluluğu, ERC CoG N ° 682938 tarafından Evalve ve bir Fransız devlet Fonu ANR-10-LABX-0030-INRT grant tarafından yönetilen tarafından Agence Nationale de la Recherche çerçeve programı Investissements d’Avenir altında ANR-10-IDEX-0002-02 etiketli.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. . Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
