Generación de plantas transgénicas con inserciones de la solo-copia usando Vector binario BIBAC-GW
Summary
Usando un vector binario pBIBAC-GW hace generar plantas transgénicas con inserciones intactas de solo-copia, un proceso fácil. Aquí, se presenta una serie de protocolos que guían al lector a través del proceso de generación de plantas transgénicas de Arabidopsis y prueba de las plantas para la integridad y copiar el número de los insertos.
Abstract
Durante la generación de plantas transgénicas, generalmente el objetivo es que la expresión estable de un transgen. Esto requiere una integración del transgén, sola, intacta como integraciones de copia múltiple a menudo son objeto de silenciamiento génico. El vector binario compatible con Gateway basado en cromosomas artificiales bacterianos (pBIBAC-GW), como otros derivados de pBIBAC, permite la inserción de los transgenes de la solo-copia con eficacia alta. Como una mejora a la original pBIBAC, un cassette de Gateway ha sido clonado en pBIBAC-GW, para que las secuencias de interés pueden ahora ser fácilmente incorporadas en la transferencia vector DNA (T-DNA) Gateway clonando. Comúnmente, la transformación con pBIBAC-GW resulta en un rendimiento de 0.2 – 0.5%, por el que la mitad de los transgénicos llevan una integración solo copia intacta del T-ADN. Los vectores pBIBAC-GW están disponibles con resistencia a glufosinato-amonio o DsRed fluorescencia en las capas de semilla para la selección de las plantas y con resistencia a la kanamicina como una selección de las bacterias. Aquí, se presenta una serie de protocolos que guían al lector por el proceso de generación de plantas transgénicas mediante pBIBAC-GW: a partir de la recombinación de las secuencias de interés en el vector de pBIBAC-GW de elección, a la planta de transformación con Agrobacterium, selección de los transgénicos y las pruebas de las plantas para la integridad y número de copia de los partes movibles utilizando ADN borrar. Se presta atención al diseño de una estrategia de Blot de DNA a reconocer solo y multi copy integraciones en loci únicos y múltiples.
Introduction
Durante la generación de plantas transgénicas, generalmente el objetivo es que el integrado transgene(s) estable expresado. Esto puede lograrse por integraciones copia intacta de un transgen. Integraciones múltiples pueden conducir a aumento de la expresión de un transgen, sino también al silenciamiento génico. Silenciamiento de transgenes es más probable si las secuencias insertadas están dispuestas en tándem o repeticiones invertidas1,2,3,4. Vectores binarios se utilizan como lanzaderas en Agrobacterium-mediada por experimentos de transformación a entregar las secuencias de interés en genomas de plantas. El número de integraciones en el genoma de una planta es dependiente en el número de copias del vector binario en Agrobacterium tumefaciens5,6. Muchos vectores binarios utilizados son vectores de alta copia y por lo tanto producir un número de copia del transgen promedio alto: 3.3 a 4.9 copias en Arabidopsis5.
El número de integraciones de T-DNA puede reducirse mediante el uso de vectores binarios que tienen un número de copia baja en a. tumefaciens, como BIBAC7o lanzando un T-DNA de a. tumefaciens cromosoma5. El número medio de integración del transgén en tales casos es inferior a 25,8,9,10. Debido a que solo copia en a. tumefaciens y también en Escherichia coli, derivados de la BIBAC pueden mantener y ofrecer construcciones tan grandes como 150 kb11.
GW-compatible BIBAC vectores10,12 permiten fácil introducción de los genes de interés en el vector mediante clonación de Gateway. El uso de la tecnología Gateway simplifica enormemente el procedimiento de clonación, pero también supera problemas comunes asociados con gran número de copias bajo vectores13,14, tales como un bajo rendimiento de ADN y una selección limitada de restricción única sitios disponibles para la clonación7,11. Los derivados pBIBAC-GW están disponibles con cualquier resistencia al glufosinato-amonio (pBIBAC-BAR-GW) o fluorescencia DsRed en las capas de semilla (pBIBAC-RFP-GW) para la selección de las plantas (figura 1)10,12. Para ambos vectores, se utiliza un gen de resistencia a kanamicina como el marcador de selección en las bacterias.
Se combinan los vectores pBIBAC-GW: diseño (1) fácil y manipulación genética en e. coliy (2) intacto solo copia integraciones en planta con alta eficiencia. La producción de vectores pBIBAC-GW en integraciones promedio 1.7 en Arabidopsis con aproximadamente la mitad de las plantas transgénicas con un solo había integrado T-ADN10.
La expresión estable de transgenes es un requisito para la mayoría transgénicos generados. Expresión del transgén estable puede lograrse mediante integraciones intactos, solo copia. Sin embargo, trabajar con plantas transgénicas portadoras de integraciones intactos, solo copia es aún más importante si por ejemplo, el objetivo es estudiar la eficiencia de los procesos basados en la cromatina, como la mutagénesis, recombinación, o reparación y la dependencia de estos procesos en la localización genómica y la estructura de la cromatina en el sitio de inserción. Para nuestro interés, para estudiar la dependencia de mutagénesis de oligonucleótidos dirigidos (ODM) en el contexto genómico local, un conjunto de líneas de reportero con integraciones intactos, solo copia de un gen reportero de mutagénesis fue generado (figura 2)10. Mediante este conjunto de líneas, fue demostrado que la eficacia ODM varía entre loci transgénicos integrados en diversas localizaciones genómicas, a pesar de los niveles de expresión de transgenes siendo algo similar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Crítica a la generación de transgénicos con integraciones individuales, intactos de un transgen es la elección del vector binario utilizado. Vectores familia BIBAC se han utilizado para proporcionar secuencias de intereses a muchos planta especie23,24,25,26,27,28. Vectores de la BIBAC, incluyendo BIBAC-GW, rendimiento sol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación es apoyada por el holandés tecnología Fundación STW (12385), que forma parte de la organización de países bajos para la investigación científica (NWO), y que en parte es financiado por el Ministerio de economía (OTP Grant 12385 a MS). Agradecemos a Carol M. Hamilton (Universidad de Cornell, Estados Unidos) para proporcionar la pCH20, la columna vertebral de los vectores de la BIBAC GW.
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
References
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