Här presenterar vi en ny metod för partiell resektion av vänster nedsatt LOB i neonatal (dag 0) möss. Detta nya protokoll är lämplig för att studera akut leverskada och skada svar i neonatal inställningen.
Morfologiska orgel förnyelse efter akut vävnad förlust är vanligt bland lägre ryggradsdjur, men observeras sällan i däggdjur postnatal liv. Vuxna lever förnyelse efter 70% partiell hepatectomy resulterar i hepatocyte hypertrofi med vissa replikering i återstående lober med restaurering av metabolisk aktivitet, men med permanent förlust av den skadade loben morfologi och arkitektur. Här, detalj vi en ny kirurgisk metod i det nyfödda barnet som lämnar en fysiologisk miljö bidrar till förnyelse. Denna modell innebär amputation av vänster LOB spetsen och en efterföljande konservativ behandlingsregim, och saknar nödvändigheten för ligering av stora levern kärl eller kemisk skada, lämnar en fysiologisk miljö där regenerering kan förekomma. Vi förlänga detta protokoll till amputationer på juvenil (P7-14) möss, under vilken den skadade levern övergångar från orgel förnyelse till kompensatoriska tillväxten av hypertrofi. Presenteras, kort 30 min protokollet ger en ram för att studera mekanismerna för regenerering, dess ålder-associerade nedgång hos däggdjur och karakterisering av förmodad nedsatt stammen eller stamfäder.
Förmågan att regenerera ett organ, eller att återställa form och funktion, har ansetts vara mestadels förlorade evolutionära tiden. Regenerativ potentialen hos den vuxna däggdjur levern efter akut kemisk eller fysisk skada har befunnits innebära mobilisering av alla återstående hepatocyter vilket resulterar i vågor av hypertrofi och några rundor av celldelning, vilket resulterar i en funktionell men arkitektoniskt olika organ1,2,3,4,5. Studier har nyligen börjat karakterisera regenerativ svar på neonatal däggdjur organ skada inom den första veckan av livet6,7,8. Dessa studier har visat att när skadad under neonatal utveckling, svarar vissa däggdjur organ med morfologiska förnyelse i stället för kompenserande tillväxt eller fibros7,8.
Nyligen genomförda studier har visat att förnyelse av både globala struktur och funktion uppstår under den tidiga neonatala periodiska6,7,8. Etablerade leverskada protokoll innebär kemisk skada eller administrering av etanol9,10,11, paracetamol12,13,14,15 , koltetraklorid16,17,18,19, 70% partiell hepatectomy4,20,21, eller avlägsnande av vänster och Median lober. Kemiska administration leder till hepatocyte celldöd, men ofta lämnar mikro – och makro-strukturer intakta. Morphologic förnyelse kan inte lätt studeras i detta sammanhang som den övergripande nedsatt arkitekturen inte var utplånas. Den 70% partiell hepatectomy innebär suturen ligering av större fartyg, som är nödvändiga för att stoppa blödning, men lämnar en icke-fysiologisk miljö med permanent avbrott i kärlsystemet. Dessutom denna metod endast använts på vuxna gnagare, och dess tillämpning på nyfödda är tekniskt mycket svårt. Med detta i åtanke vi utvecklat en metod där 20-30% av spetsen av den vänstra loben avlägsnas i en nyfödd P0-mus (figur 1A-1B). Denna metod är kirurgiskt konservativ, minimalt invasiv, inte tekniskt utmanande, och leder till brutto förlust av morfologi utan ligering av kärlsystemet, vilket lämnar utrymme för förnyelse ska ske. Protokollet för det resulterande stegvisa, beskrivs nedan, kan för någon forskare att utföra en partiell lobulär hepatectomy på neonatala möss för att studera däggdjur neonatal förnyelse i de tidiga stadierna av postnatal liv. Denna metod har också tydliga ansökningar till jämförande studier inom regenerativ medicin och stamcellsbiologi, eftersom den kan användas i levern under senare skeden av livet.
De vanligaste akut leverskada studierna är kemiskt-inducerad skada, vuxen lever amputation eller 70% partiell hepatectomy. Kemiska skador ofta innebär intravenös, intraperitoneal eller oral administrering av paracetamol, koltetraklorid eller etanol, och är en relativt lätt och icke-invasiv skador modell. Som tidigare diskuterats, kemiska skador resulterar i hepatocyte celldöd, men ofta bladen stroma och parenkymet strukturer intakta, vilket gör det svårt att göra påståenden om morphologic regenerering. Kemiska skador centers ofta på nedsatt fartyg, vilket gör det till en användbar teknik för att studera webbplats och cell-specifika skada, men också gör det svårt att förhöra, på nivån hela orgel, andra populationer som får befinna sig längre från fartyg och som kan bidra till förnyelse. Trots dessa begränsningar, kemiska skador är fortfarande en användbar och mycket fysiologiskt relevanta skador modell.
Vuxen 70% partiell hepatectomy innebär avlägsnande av vänster och median loberna efter ligering av nedsatt kärlsystemet. Att bemöta hepatectomy har karakteriserats väl: amputerade levern 14 dagar post 70% partiell hepatectomy framkallar en grovt annan arkitektur än den ursprungliga oskadade loben, som hepatocyterna av resterande höger och caudatus loberna genomgå hypertrofi och ett par rundor av celldelning4,5. Detta gör upp förlorade massa och funktion, men misslyckas att regenerera två amputerade loberna och därför ersätta inte brutto morfologi. Som ett resultat, är 70% partiell hepatectomy skada svar användbart att studera kompensatoriska tillväxten mekanismer med begränsad regenerering.
Här beskriver vi fullt ett protokoll för en neonatal partiell lobulär hepatectomy. Förfarandet innebär att lämpliga djur urval och förberedelse, operationsområdet förberedelse, operation och återhämtning. Optimering och anpassning av dessa steg kan krävas för olika tillämpningar av protokollet.
Vi har i stor utsträckning utfört och optimerad detta protokoll på vildtyp C57BL/6J valpar (JAX 000664), dock för att studera olika cellpopulationer och mekanismer för regenerering, vi använde också olika transgena djur inklusive möss härbärgerat olika Cre och CreERT2 transgener eller knock-ins (Axin2CreERT2 JAX 018867, och Sox9CreERT2 JAX 018829) i kombination med fluorescerande reportrar, såsom de Rainbow och mTmG system (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. Vi hittade ingen anledning att ändra denna metod för olika mus stammar, som observerades inga skillnader i överlevnad utfall eller regenerativ potential.
Förutom att använda olika djura stammar, genomfört vi även partiell lobulär hepatectomies på neonatala möss behandlades med små molekyler, såsom 4-hydroxi-tamoxifen och 5-ethynyl-2′-deoxiuridin (EdU). Dimetyl sulfoxid (DMSO) och etanol användes som lösningsmedel, eftersom det konstaterades att majs olja var en betydande orsak till sjuklighet. Vi hittade annars att intraperitoneal administrering av små molekyler inte påverkar överlevnad eller regenerativ resultat. Vi förutspår att detta protokoll kommer att anpassas för användning med andra små molekyler att förhöra olika aspekter av regenerering.
Neonatal mus operationer kan vara tekniskt utmanande och kan kräva särskild sakkunskap i djurhantering och mikroskopisk dissektion. Djurhållningen expertis är nödvändig för att undvika maternell kannibalism efter operationen och under den omedelbara återhämtningsperioden.
Akut leverskada har traditionellt studerats med hjälp av kemiska (paracetamol, etanol, koltetraklorid) eller kirurgisk modeller (70% partiell hepatectomy). Regenerativ svaret efter 70% partiell hepatectomy karaktäriserats för att engagera globala hepatocyte hypertrofi och flera rundor av celldelning4,5. För att stoppa blödningen, är denna modell dock begränsad, eftersom de största fartyg måste vara sammanskrivna lämnar en onormal miljö för regenererin…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar P. Chu för att utföra H & E och histologi; och C. Wang och A. McCarty för bra diskussioner. Forskning stöddes genom finansiering från Virginia och D. K. Ludwig Fund för cancerforskning; den nationella hjärta, lunga och Blood Institute (R01HL058770 och U01HL099999); och California Institute for Regenerative Medicine (RC1 00354) bidrag till I.W. Y.R. stöddes av den Human Frontier Science Program karriär Development Award (CDA00017), den tyska forskningsfondens (RI 2787/1), Siebel Stem Cell Institute, och den Thomas och Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. stöddes av NIH (T32GM007365), National Research Service Award (1F30DK108561), och Paul och Daisy Soros Fellowship för nya amerikaner.
Animals | |||
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Standard Reagents | |||
Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Standard Equipment | |||
1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |