Her presenterer vi en enkel å bruke og allsidig metode for å utføre live bildebehandling av utviklingsprosesser i generelt og muskel-sene morphogenesis spesielt i levende Drosophila pupae.
Musklene sener og skjelettet aktiverer dyr inkludert mennesker for å flytte sine kroppsdeler. Muskel morphogenesis er svært bevart fra dyr til mennesker. Kraftig Drosophila modellsystem kan derfor brukes til å studere konsepter av muskel-sene utvikling som kan også bli brukt til menneskelig muskel biologi. Her beskrive vi i detalj hvordan morphogenesis av voksen muskel-sene systemet kan være lett avbildet i levende, utvikle Drosophila pupae. Derfor kan metoden undersøke proteiner, celler og vev i fysiologiske miljøet. I tillegg til en trinnvis protokoll med nyttige tips gir vi en omfattende oversikt over fluorescently merket markør proteiner som er egnet for å studere muskel-sene systemet. For å markere det allsidige søknadene av protokollen, viser vi eksempel filmer mellom visualisering av langsiktig Morfogenetiske hendelser-forekommer på tidsskalaen for timer og dager-visualisering av kortsiktige dynamisk prosesser som muskelrykninger forekommende i tidsskala sekunder. Samlet bør denne protokollen aktivere leseren å tegning og utføre live bildebehandling eksperimenter for å undersøke muskel-sene morphogenesis i intakt organismen.
Muskel-sene apparatet gjør dyr inkludert mennesker for å flytte sine kroppsdeler. Molekylær byggesteinene i muskel-sene systemet er svært bevart. Derfor kan begrepene muskel-sene utvikling relevante for menneskelig muskel biologi, for eksempel muskel morphogenesis, muskel-sene vedlegg og myofibril selv-organisering, studeres bruker Drosophila melanogaster som en lett tilgjengelig modellsystem. Pupal systemet Drosophila har flere eksperimentelle fordeler. Først på pupal scenen-er når voksen musklene er dannet-organismen fastsittende og derfor lett å bildet på et mikroskop løpet av timer eller dager. Andre, mange muskler form nært nok under pupal overflaten slik at de kan avbildes i intakt, delvis gjennomsiktig organismen. Tredje kan musklene undersøkes i sitt naturlige miljø, hvor de er koblet til den danner exoskeleton via sene celler og vev spenning er bygget opp. Dette er ikke mulig i muskel celle kultur systemer. Og til slutt, en overflod av genetisk verktøy finnes i Drosophila. Blant disse er mange fluorescently merket markører at merking av spesifikke celletyper eller subcellular strukturer for bildebehandling i vivo.
Tabell 1 oppsummerer de viktigste markørene brukes for å studere muskel-sene morphogenesis. Det inkluderer markører overexpressed bruker GAL4-UAS-system1 og endogenously merket protein markører2,3,4. Fordelen av GAL4-UAS-systemet er at markørene er generelt uttrykt på høye nivåer, noe som resulterer i et sterkt signal som kan enkelt avbildes i hele-mount pupae. I tillegg kan vev spesifisitet oppnås ved å velge GAL4 drivere nøye. Fordelen med fusion proteiner uttrykt endogene kontroll er at dynamikken i de respektive proteinene kan være studert i vivo, mens de kan også brukes som markører for ulike celletyper eller spesifikke subcellular strukturer, for eksempel ΒPS-Integrin-GFP for muskel vedlegg områder. Sammen gir disse markørene høy fleksibilitet i eksperimentell design og valg av forskning problemer som kan løses nå og i fremtiden.
Merket struktur | Markør | Uttrykk og lokalisering | Klassen | Artikkelnummer | Kommentar | REF. | ||||||
Muskel | Mef2-GAL4 | alle myoblasts og alle musklene i alle stadier | GAL4 linje | BL 27390 | 5 | |||||||
1151-GAL4 | voksen muskel prekursorer og tidlig myotubes til ≈24 h APF | GAL4 linje, enhancer felle | – | 6 | ||||||||
Act79B-GAL4 | hoppe muskel på differensiering | GAL4 linje | – | 7 | ||||||||
Act88F-GAL4 | indirekte flygingen musklene begynner ≈14 h APF | GAL4 linje | – | 7 | ||||||||
Act88F– Cameleon 3.1 | indirekte flygingen musklene begynner ≈14 h APF | Act88F forsterker / arrangøren kjøring Cameleon 3.1 | – | Ca2 + indikator | 8 | |||||||
Act88F-GFP | indirekte flygingen musklene begynner ≈14 h APF | GFP-fusion (fly TransgeneOme linje) | fTRG78 og fTRG10028 | 4 | ||||||||
Ham– nls-GFP | voksen muskel forløpere, kjernekraft, til ≈24 h APF i indirekte flygingen musklene | Enhancer/arrangøren med nls-GFP reporter | – | 1,5 kb enhancer fragment | 9 | |||||||
MHC-Tau-GFP | piskehale som henger i DLM maler og skille muskler | Enhancer/arrangøren med Tau-GFP reporter | BL 53739 | 10 | ||||||||
ΒTub60D-GFP | piskehale som henger i myotubes (f.eks. i indirekte flygingen musklene ≈14 h AFP, sterkt redusere etter ≈48 h APF) | GFP-fusion (fly TransgeneOme linje) | fTRG958 | 4 | ||||||||
MHC-GFP (weeP26) | sarcomeres (tykke glødetråden) i alle kroppens muskler (f.eks. i indirekte flygingen musklene fra ≈30 h APF) | GFP-felle | – | Bruk heterozygote, merker en isoformen delsett | 11 | |||||||
SLS-GFP | sarcomeres (Z-plate) i alle kroppens muskler (f.eks. i indirekte flygingen musklene fra ≈30 h APF) | GFP-felle (FlyTrap linje) | – | G53, bruk heterozygote | 2 | |||||||
Zasp66-GFP | Z-plate i alle kroppens muskler | GFP-felle (FlyTrap linje) | BL 6824 | ZCL0663 | 2 , 12 | |||||||
Zasp52-GFP | Z-plate i alle kroppens muskler | GFP-felle (FlyTrap linje) | BL 6838 | G00189 | 2 , 12 | |||||||
HTS-GFP | utgangen bindende; uttrykt i epitel, myoblasts og myotubes | GFP-fusion (fly TransgeneOme linje) | fTRG585 | 4 | ||||||||
Dlg1-GFP | tarmepitelet veikryss, myoblasts og membraner i musklene i alle stadier | GFP-fusion (fly TransgeneOme linje) | fTRG502 | 4 | ||||||||
Muskel vedlegg området | ΒPS-Integrin-GFP | muskel vedlegg områder (f.eks Start ≈18 h AFP i indirekte flygingen musklene) | GFP-knock-i | – | 13 | |||||||
Talin-GFP og -mCherry | muskel vedlegg områder (f.eks Start ≈18 h AFP i indirekte flygingen musklene) | GFP-felle (etterligne linje) | – | 3 | ||||||||
Talin-GFP | muskel vedlegg områder (f.eks Start ≈18 h AFP i indirekte flygingen musklene) | GFP-fusion (fly TransgeneOme linje) | fTRG587 | 4 | ||||||||
Ilk-GFP | muskel vedlegg områder (f.eks Start ≈18 h AFP i indirekte flygingen musklene) | GFP-felle (FlyTrap linje) | Kyoto 110951 (ZCL3111) | ZCL3111, ZCL3192 | 2 | |||||||
Vinc-GFP og -RFP | muskel vedlegg områder (f.eks Start ≈18 h AFP i indirekte flygingen musklene) | GFP-fusion (transgene) | – | 13 | ||||||||
Sene | SR-GAL4 | thorax sene celler, gjennom pupal scenen | GAL4 linje, enhancer felle | BL 26663 | homozygous dødelig | 14 | ||||||
Muskel og sene | DUF-GAL4 | muskler og epithelia, tidlig debut | GAL4 linje | BL 66682 | kirre-rP298, grunnlegger celle markør | 15 | ||||||
UAS-journalister | UAS– GFP-Gma | utgangen bindende | UAS linje | BL 31776 | utgangen bindende domene i Moesin del GFP | 16 | ||||||
UAS– mCherry-Gma | utgangen bindende | UAS linje | – | GMA del mCherry | 17 | |||||||
UAS- Lifeact-GFP | utgangen bindende | UAS linje | BL 35544 | 18 | ||||||||
UAS– Lifeact-Ruby | utgangen bindende | UAS linje | BL 35545 | 18 | ||||||||
UAS-CD8-GFP | membran bindende | UAS linje | ulike aksjer, f.eks: BL 32184 | 19 | ||||||||
UAS-CD8-mCherry | membran bindende | UAS linje | BL 27391 og 27392 | 20 | ||||||||
UAS-palm-mCherry | membran binde via palmitoylation | UAS linje | BL 34514 | UAS– brainbow | 21 |
Tabell 1: Merket Fluorescently protein markører egnet for studerer muskel-sene morphogenesis i vivo.
Her vi beskrive i detalj hvordan avbilding av muskel-sene morphogenesis i levende pupae kan utføres enkelt og vellykket (figur 1). Alternativt pupae kan være faste, dissekert og immunostained, som tillater bruk av antistoffer også merke proteiner som ingen lever markører er tilgjengelig22. I dette tilfellet er tenkelig kvaliteten generelt høyere fordi det er ingen bevegelse og strukturen av interesse kan plasseres i nærheten av dekkglassvæske. Men disseksjon og fiksering kan føre til skader og molekylære eller vev dynamikk, for eksempel muskel rykninger, kan bare bli studert i den levende organismen.
Presentert protokollen beskriver hvordan muskel-sene morphogenesis i levende Drosophila pupae bruker en rekke fluorescently merket proteiner. Denne i vivo imaging strategi kan brukes å studere utviklingsprosesser i sitt naturlige miljø av hele organismen.
Det er avgjørende for en vellykket eksperiment for å finne riktig utviklingsmessige tidspunktet å analysere. For eksempel starte dorsolongitudinal indirekte flygingen musklene vedlegg sine sene mål på ≈16 h APF23 mens magemusklene utvikler senere og fest på begge ender bare mellom 30 og 40 h APF26. Følgelig tidligere publisert litteratur skal brukes til å finne riktig tidspunkt utvikling analysere eller hvis vev eller struktur rundt ikke har blitt studert i detalj før, den generelle utviklingen har å være preget første.
For montering pupae på spesialbygde plast lysbildene, er det viktig at sporene har egnede dimensjoner: grooves måtte være 1.0-1,5 mm bred og 0,3 – 0.4 mm dyp. Denne dybde kan justere den nøyaktige avstanden til den beste dekkglassvæske med avstand coverslips etter behov. Minst ett mellomrom dekkglassvæske bør imidlertid brukes å unngå drenering 50% glycerol fra utvalget av kapillære krefter. Riktig posisjonering pupae i sporet krever noen erfaring og skal være optimalisert slik at strukturen av interesse er så nær som mulig til dekkglassvæske.
Hvis et stort antall pupae skal avbildes i et mikroskop-økt, kan alle montert på forhånd og deretter lagret i en inkubator til å sikre riktig utviklingsmessige timing. Pupae skal overleve hele prosedyren og også minst prøve å dra hvis holdt på lysbildet etter bildebehandling. Overlevelse kan brukes som en avlesning sjekke om tenkelig betingelsene skade pupae.
Tenkelig innstillingene skal velges nøye i henhold til eksperimentelle kravene. For kortsiktige filmer må en høy bildefrekvens versus en høy signal-til-støy-forhold være balansert, mens relativt høy laser makt kan brukes uten å skade pupae for mye. Men for langsiktig film, laser makt må holdes på et moderat nivå og pupae bør ikke avbildes kontinuerlig men heller på bestemte tidspunkt, for eksempel hvert 20 min. For å sikre at strukturen av interesse ikke flytte ut av synsfeltet, kan det være nødvendig å justere plasseringen av z-stakken mellom tidspunkt. Vi vet påvirker åpningen av pupal saken sådan ikke utviklingsmessige timing. Et temperaturkontrollert stadium bør imidlertid brukes for langsiktig filmer for å sikre riktig utviklingsmessige timing. Holde disse hensyn i tankene, kan svært informativ filmer skaffes.
Presentert protokollen kan brukes å visualisere ikke bare muskel-sene morphogenesis, men også andre utviklingsland vev, for eksempel fløyen epitel29. Bare tre endringer denne protokollen er nødvendig: (1) åpning av pupal saken over vingen i stedet for syn eller magen, (2) plassering av pupae med vingen mot den øverste dekkglassvæske, og (3) bruk av ulike fluorescerende markør proteiner. Med fremme av CRISPR/Cas9-teknologi, vil mer endogenously merket fluorescerende proteiner være tilgjengelig, fordi det har blitt enklere å målrette endogene loci i Drosophila30,31 , 32. i fremtiden, vil dette tillate Klargjørende dynamikken i mange proteiner, celler og hele vev i fysiologiske miljøet i detalj.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Manuela Weitkunat for oppkjøpet av filmen S3. Vi er takknemlige for Reinhard Fässler for sjenerøs støtte. Dette arbeidet ble støttet av EMBO unge etterforsker Program (F.S.), europeiske forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), Max Planck samfunnet (S.B.L., F.S.), den Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), excellence initiativ Aix-Marseille University AMIDEX (F.S.), LabEX-INFORMER (F.S.) og Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).
Stereomicroscope | Leica | MZ6 | product has been replaced by Leica M60 |
fly food in bottles (or vials) | – | – | standard culture medium |
paint brush | da Vinci | 1526Y | size 1 |
microscope slides | Thermo Scientific | VWR: 631-1303 | 76 x 26 mm |
double-sided tape (optional) | Scotch | 6651263 | 12 mm x 6.3 m |
petri dishes | Greiner Bio-One | 632102 | 94 x 16 mm |
paper tissues | Th.Geyer | 7695251 | |
forceps #5 (Dumont, inox, standard) | Fine Science Tools | 11251-20 | 0.1 mm x 0.06 mm tip |
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) | Fine Science Tools | 11252-20 | 0.05 mm x 0.02 mm tip |
Cohan-Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | straight tip |
plastic slides with a groove (reusable) | custom-built | – | 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove |
coverslips | Marienfeld | 107032 | 18 x 18 mm, No. 1.5H |
glycerol | Sigma-Aldrich | 49781 | dilute to 50 % in water |
adhesive tape | Tesa | 57370-02 | 1.5 mm x 10 m |