Cultura di cellule staminali pluripotenti umane il polivinil alcool-Co-itaconico acido idrogel con diverse rigidità nelle circostanze senza Xeno
Summary
Un protocollo è presentato per preparare polivinil alcool-co-itaconico acido idrogel con rigidità variabile, che sono stati innestati con e senza oligopeptidi, per studiare l’effetto della rigidità dei biomateriali sulla differenziazione e proliferazione delle cellule staminali. La rigidità nel caso degli idrogeli fu controllata dal tempo di reticolazione.
Abstract
L’effetto di segnali fisici, ad esempio la rigidità dei biomateriali sulla proliferazione e differenziazione delle cellule staminali, è stato studiato da diversi ricercatori. Tuttavia, la maggior parte di questi investigatori hanno utilizzato idrogel di poliacrilamide per coltura della cellula formativa nei loro studi. Pertanto, i loro risultati sono discutibili perché tali risultati potrebbero provenire dalle caratteristiche specifiche del poliacrilammide e non dallo spunto fisico (rigidità) dei biomateriali. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di idrogeli, che non si basano su poliacrilammide, dove vari staminali, cellule compreso le cellule staminali embrionali umane (ES) e umane pluripotenti indotte (iPS) staminali, può essere coltivato. Idrogel con rigidità variabile sono stati preparati da bioinerte polivinil alcool-co-itaconico acido (P-IA), con rigidità controllata dal grado di reticolazione cambiando tempo di reticolazione. Nel caso degli idrogeli P-IA innestato con e senza oligopeptidi derivato dalla matrice extracellulare sono stati studiati come una futura piattaforma per la coltura delle cellule staminali e differenziazione. La cultura e il passaggio di cellule staminali del liquido amniotico, cellule staminali adiposo-derivate, cellule ES umane e cellule umane iPS è descritto in dettaglio qui. Nel caso degli idrogeli oligopeptide P-IA ha mostrato prestazioni superiori, che sono state indotte dalle loro proprietà di rigidità. Questo protocollo riporta la sintesi del biomateriale, loro manipolazione superficiale, insieme a controllare le proprietà di rigidezza e infine, il loro impatto sul destino delle cellule staminali utilizzando condizioni di coltura privo di xeno. Basato su studi recenti, tali substrati modificate possono fungere da piattaforme future per sostenere e dirigere il destino di varie cellule staminali linea per diversi collegamenti; e inoltre, rigenerare e ripristinare le funzioni dell’organo perso o tessuto.
Introduction
Il destino del differenziamento di cellule staminali in un lignaggio specifico delle cellule e la proliferazione delle cellule staminali, soprattutto umane pluripotenti indotte (iPS) e cellule staminali embrionali umane (ES), a lungo termine è noto per essere regolata da inibitori, fattori di crescita, e / o piccole molecole bioattive in terreni di coltura. Recentemente, i segnali fisici dei biomateriali, in particolare la rigidità dei biomateriali di coltura delle cellule, sono stati riconosciuti per essere un fattore importante che guida il destino delle cellule staminali proliferazione e differenziazione1,2, 3,4,5,6. Di conseguenza, diversi ricercatori hanno iniziato a investigare sul destino delle cellule staminali, che sono coltivati su idrogeli, sulla differenziazione, principalmente utilizzando idrogel di poliacrilamide con rigidità diverse.
La rigidità dei biomateriali possa controllare adesioni focali, morfologia delle cellule, fenotipo delle cellule e adesione delle cellule staminali, soprattutto in bidimensionale (2D) coltivazione1,2,3,5. Meccano-rilevamento di biomateriali di cellule staminali è generalmente controllata di segnalazione tramite recettori integrinici focale di adesione. NMMIIA, miosina non muscolare contrattilità IIA-dipendente del citoscheletro di actina svolge un ruolo critico nel processo di mechanosensing delle cellule staminali in 2-D cell coltivazione sistemi3,4,5, 7,8,9,10,11.
Engler e i suoi colleghi ha sviluppato un concetto interessante che cellule staminali adulte, quali midollo osseo le cellule staminali (BMS) coltivate sui biomateriali di cultura delle cellule con una rigidità simile a quella di tessuti specifici, tendono a differenziarsi in cellule ha provenute da tessuti specifici5. BMS cellule incubate su idrogel di poliacrilamide morbido 2-D rivestito con collagene di tipo I (con una rigidità paragonabile a quella dei tessuti cerebrali) nei media espansione fossi spontaneamente indotte a differenziarsi in linee cellulari di neurone iniziale, considerando che BMS cellule coltivate su idrogel con una rigidità simile a quella del muscolo o tessuti collagena dell’osso sono stati trovati per indurre la differenziazione in primi lignaggi di miociti e osteoblasti, rispettivamente, il 2-D poliacrilammide idrogeli3,5. Molti ricercatori hanno studiato il destino delle cellule staminali di differenziazione coltivate su poliacrilammide idrogeli immobilizzati con collagene tipo I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Tuttavia, va ricordato che alcune contraddittorie segnala1,18,22,23,24 esiste per il ben noto idea suggerita da Engler et al. 5 questo è perché idea5 di Engler è stato sviluppato esclusivamente su idrogel di poliacrilamide e i loro risultati hanno avuto origine da caratteristiche specifiche di biomateriale (poliacrilammide) e non solamente dalla stecca fisica (rigidità) di il biomateriale. Pertanto, è importante sviluppare un altro tipo di idrogel, di cui la rigidità può essere controllata da reticolazione nel caso degli idrogeli. Per questo scopo, bioinerte idrogeli sono stati sviluppati, che sono stati preparati da polivinil alcool-co-itaconico acido (P-IA) con una diversa rigidezza, che era controllata dal grado di reticolazione con un cambiamento reticolazione tempo25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. le cellule staminali possono essere coltivate su nonmodified P-IA idrogeli, come pure P-IA idrogeli innestati con matrici extracellulari (ECMs) e oligopeptidi. In un precedente studio25, cellule staminali ematopoietiche umane (hHSCs) da sangue del cordone ombelicale sono state coltivate su P-IA idrogel con valori di rigidità differenti che vanno da un 3 kPa a 30 kPa modulo elastico dove fibronectina o un oligopeptide derivato da fibronectina (CS1, EILDVPST) è stata innestata nel caso degli idrogeli P-IA. Alta ex vivo piega espansione di hHSCs è stata osservata nel caso degli idrogeli P-IA innestato con CS1 o fibronectina, che visualizzata una rigidità intermedia che vanno da 12 kPa a 30 kPa25.
IPS umano e cellule ES non possono essere coltivate coltura convenzionale polistirolo (TCP) piatti33,34 ES umano e cellule iPS richiedono legame specifico con ECMs, come vitronectina o laminina per mantenere la loro pluripotenza durante la coltura a lungo termine. Di conseguenza, diverse strutture di idrogeli di P-IA oligopeptide-innestati con caratteristiche di rigidità ottimale sono stati progettati e preparati nelle formazioni di una singola catena, una catena singola con un segmento comune, una doppia catena con un segmento comune e un tipo di ramificata catena32. Oligopeptide sequenze sono stati selezionati da domini di integrina e glicosaminoglicani-associazione di ECMs. Nel caso degli idrogeli P-IA innestato con oligopeptidi vitronectin-derivati con una doppia catena o un segmento comune, che hanno un modulo di deposito a circa 25 kPa, supportata la coltura a lungo termine di ES umano e cellule iPS per oltre 12 passaggi sotto privo di xeno e chimica condizioni definite32. Il segmento comune e doppia catena con molecole di adesione cellulare nel caso degli idrogeli facilitato la proliferazione e pluripotenza delle umane ES e iPS celle32. Qui, un protocollo per la preparazione di idrogeli di P-IA (con un modulo di deposito da 10 kPa a 30 kPa, che è stata misurata in condizioni di umide nell’aria) innestato con e senza oligopeptidi o ECMs è descritto. Viene mostrato come cultura e passaggio parecchie cellule staminali (tra cui le cellule staminali del liquido amniotico, cellule staminali adiposo-derivate, cellule ES umane e cellule umane iPS).
Protocol
Representative Results
Discussion
P-IA-oligoECM e P-IA-ECM idrogel con rigidità variabile sono stati sviluppati per l’espansione a lungo termine di ES umano e cellule iPS mantenendo la loro pluripotenza per oltre dieci passaggi in condizioni prive di xeno, così come per la coltura di cellule umane di AFS, cellule di annunci, e le cellule staminali emopoietiche25,28,32. P-IA idrogeli immobilizzati con oligoECM sono un candidato eccellente per materiali di colti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata parzialmente sostenuta dal Ministero della scienza e tecnologia, Taiwan sotto grant numeri 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 e 104-2221-E-008-107-MY3. Questa ricerca è stata sostenuta anche dal Taiwan Landseed ospedale progetto (NCU-LSH-105-A-001). Una sovvenzione per la ricerca scientifica (numero 15K 06591) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone è anche riconosciuto. R. Higuchi desidera ringraziare per il programma di partenariato scientifico internazionale (ISPP-0062) Vice Rettorato per gli studi universitari e di ricerca, King Saud University, Riyadh 11451, Regno dell’Arabia Saudita.
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
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