Gel-seq: En metode for samtidige sekvensering biblioteket utarbeidelse av DNA og RNA bruker Hydrogel matriser

Summary

Gel-seq kan forskere samtidig forberede biblioteker for begge DNA – og RNA-seq ubetydelig ekstra kostnad fra 100-1000 celler ved hjelp av en enkel hydrogel enhet. Dette dokumentet presenterer en detaljert tilnærming til fabrikasjon av enheten samt biologiske protokollen for å generere sammenkoblede biblioteker.

Abstract

Muligheten til å forsterke og sekvensielt DNA eller RNA fra små start utvalg er bare oppnådd de siste fem årene. Dessverre standardprotokoller for generering genomisk eller transcriptomic biblioteker er inkompatible og forskere må velge om du vil sekvens DNA eller RNA for en spesiell prøve. Gel-seq løser dette problemet ved å aktivere forskere samtidig forberede biblioteker både DNA og RNA starter med 100-1000 celler ved hjelp av en enkel hydrogel enhet. Dette dokumentet presenterer en detaljert tilnærming til fabrikasjon av enheten samt biologiske protokollen for å generere sammenkoblede biblioteker. Vi designet Gel-seq slik at det lett kan implementeres av andre forskere; mange genetikk labs har allerede det nødvendig utstyret for å reprodusere Gel-seq apparat fabrikasjon. Våre protokollen bruker brukte Kit for både hel-transkripsjon forsterkning (WTA) og biblioteket forberedelse, som også er sannsynlig å være kjent for forskere allerede bevandret i generere genomisk og transcriptomic biblioteker. Vår tilnærming kan forskere å få til å bære kraften i både DNA og RNA sekvensering på et enkelt utvalg uten deling og med ubetydelig ekstra kostnad.

Introduction

Neste generasjons sekvensering (NGS) har hatt en betydelig innflytelse på måten genetikk forskning er utført. Der forskere når fokusert på sekvensering genomet av en hel Art, er det nå mulig å sekvens genomet av en enkelt svulst eller selv en enkeltcelle i ett eksperiment. ¹ NGS har også gjort det kostnadseffektivt å sekvens RNA transkripsjoner funnet i en celle, en samling av data kjent som transcriptome. Muligheten til å forsterke og sekvensielt DNA eller RNA fra små start utvalg er bare oppnådd de siste fem årene. ^{2 , 3 , 4} dessverre standardprotokoller er inkompatible og forskere må velge om du vil sekvens DNA eller RNA for et gitt utvalg. Når en første prøve er stor nok, kan det deles i to. På mindre skalaer, men tap av materiale på grunn av deling prøver kan påvirke biblioteket kvalitet, og av prøver kan jevne ut interessante variasjoner mellom celler. ⁵ videre forskere er stadig mer interessert i å undersøke prøver som ikke kan deles, for eksempel enkeltceller eller liten heterogene svulst biopsier. ⁶

For å løse dette problemet, tre protokoller har nylig blitt bebygget for å sekvens både DNA og RNA fra samme Start eksempel: Gel-seq⁷G & T-seq⁸og DR-seq⁹. Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for Gel-seq, som kan brukes samtidig generere DNA og RNA biblioteker fra så lite som 100 celler ubetydelig ekstra kostnad. Romanen aspekt av Gel-seq er evnen til å skille DNA og RNA basert på størrelse med lavpris hydrogel matriser. I kjernen av Gel-Seq-protokollen er fysisk separasjon av DNA fra RNA. Denne separasjon er oppnådd electrophoretically med en kombinasjon av polyakrylamid membraner som utnytter størrelse forskjellene mellom disse molekyler. For å sette disse størrelse forskjeller i sammenheng, vurdere hvordan DNA og RNA er avbildet: mens DNA finnes på mikro-skala og kan vises ved hjelp av tradisjonelle mikroskop, RNA finnes på nanometer skala og må avbildes bruker komplekse teknikker som cryo-elektron mikroskopi. ¹⁰

Tilnærming til skille DNA og RNA i denne protokollen er vist i figur 1. Informasjonsvinduet viser DNA og RNA fri flyt i løsning nær en membran. Når et elektrisk felt brukes, som vist i panelet til høyre, oppleve DNA og RNA en electrophoretic kraft som induserer migrasjon gjennom membranen. Ved å justere egenskapene membran, har vi opprettet et halvt gjennomtrengelig membran som skiller DNA fra RNA. DNA-molekyler er skjøvet mot membranen, men ettersittende ytterst på grunn av den store filstørrelsen. Små RNA molekyler, derimot, kan konfigurere og veve seg gjennom membranen. Denne prosessen kalles reptation, ligner måten en slange beveger seg gjennom gresset. Slutt disse RNA molekyler er stoppet av en andre, høy tetthet membran som er for vanskelig for enda mindre polymerer (> 200 base parene) å vri seg gjennom. Når fysisk skilt, kan DNA og RNA gjenopprettet og behandles for å generere informasjon om både genomet og transcriptome. Mens vi kan skille DNA og RNA, har vi funnet bedre resultater er oppnådd hvis RNA er omvendt transkribert til cDNA før separasjon. CDNA/RNA hybrider er mer stabile enn RNA alene og kan fortsatt passere gjennom lav membran.

Figur 1 . Gel-seq drift prinsippet. Underliggende prinsippet fysisk mellom DNA og RNA. I en anvendt elektrisk felt, små RNA molekyler overføre gjennom lav membran men store DNA molekyler er fanget på overflaten. Dette tallet ble reprodusert Ref. 7 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dette dokumentet beskriver i detalj både fabrikasjon av Gel-seq enheten og biologiske protokollen for å generere sammen DNA og RNA biblioteker. En oversikt over begge vises i figur 2. Enheten er fabrikkert av lagdeling tre forskjellige tetthet polyakrylamid gels oppå hverandre i en prosess som ligner til å skape standard stabling gels. ¹¹ biologiske protokollen starter med 100-1000 celler suspendert i PBS. Cellene er lysed og RNA konverteres til cDNA før enheten brukes til å skille genomisk DNA fra cDNA/RNA hybrider. Etter separasjon og utvinning, genomisk og transcriptomic lages biblioteker av en prosess som følger tett hele-genome standardbiblioteket forberedelse kit protokollen. Ytterligere detaljer om utvikling og validering av Gel-seq kan leses i laboratoriet med en Chip publikasjon “Gel-seq: hele-genom og transcriptome sekvensering av samtidige lav-input DNA og RNA biblioteket forberedelse på halvt gjennomtrengelig hydrogel barrierer .” ⁷

Figur 2 . Gel-seq protokollen. En oversikt over trinnene for å dikte Gel-seq enheten og protokollen generert sammen DNA og RNA biblioteker. Deler av dette tallet ble reprodusert Ref. 7 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Vil generere DNA og RNA biblioteker fra enkeltceller, forskere bør vurdere å bruke enten G & T-seq eller DR-seq. G & T-Seq, som Gel-seq, avhengig av en fysisk separasjon av fra genomisk DNA. Denne tilnærmingen er avhengig av budbringer RNA (mRNA) 3 polyadenylated halen som rullegardin mål. MRNA fanges opp på en magnetisk perle ved hjelp av en biotinylated oligo-dT primer. Når mRNA har blitt fanget perlene holdes på plass med en magnet og nedbryting inneholder genomisk DNA kan fjernet og overført til en annen tube. Når denne fysisk separasjon er fullført, kan separat biblioteker genereres fra mRNA og DNA. ⁸ denne tilnærmingen fungerer godt hvis RNA rundt polyadenylated, men den kan ikke brukes til å studere ikke-polyadenylated utskrifter, for eksempel ribosomal RNA, tRNA eller RNA fra prokaryoter.

DR-seq er avhengig av en før forsterkning trinn der både DNA og cDNA avledet fra RNA er forsterket i samme rør. Prøven er deretter delt i to og behandles parallelt å forberede DNA og RNA seq biblioteker. Du kan skille mellom genomisk DNA og cDNA avledet fra RNA, tar DR-seq en beregningsorientert tilnærming. Sekvenser hvor bare exons finnes undertrykt beregningsmessig i genomisk DNA data, som de kan ha sin opprinnelse fra DNA eller RNA. ⁹ en fordel med denne tilnærmingen er at DNA og cDNA/RNA ikke trenger være fysisk atskilt som er gjort i Gel-seq og G & T-seq. Ulempen er imidlertid at DR-seq krever en priori kunnskap om genomet og transcriptome (dvs., exons versus introns), og kan ikke være perfekt for programmer som sekvensering av kjerner, der mange transkripsjoner ikke er ennå fullt skjøtes og fremdeles inneholde introns. ¹²

Romanen aspekt av Gel-seq er muligheten til å skille DNA og RNA i hundrevis av cellene basert på størrelse. Denne metoden krever ikke en priori kunnskap om genomet eller transcriptome, er robuste mot ufullstendig skjøting, og er ikke begrenset til poly-adenylated utskrifter. For applikasjoner der en forsker kan starte med minst 100 celler, gir Gel-seq en enkel tilnærming med billig og lett tilgjengelig.

Protocol

1. kjemisk løsning forberedelse Merk: Følgende er for å forberede kjemiske lobbyer i senere trinn. Dette kan gjøres i bulk og lagret i flere måneder. For å begynne, forberede 50 mL av renset, deionisert vann ved sterilisering i en 254 nm UV crosslinking ovnen i 15 minutter (15 mJ/cm2 total eksponering) for å nøytralisere eventuelle skadelige DNA. Varme 37 ° c for bruk i følgende. Gjøre 10 mL av en 40% total (T) og 3,3% crosslinker (C) (29:1) polyakryla…

Representative Results

Fysisk separasjon av gDNA og cDNA/RNA hybrider i Gel-seq enheten kan bli visualisert gjennom fluorescerende gel avbildning; en representant resultatet er vist i Figur 3. Panelet A viser fabrikkerte Gel-seq enheten. falske farge er lagt til å skille de ulike gel regionene. Panelet B viser et nært fire forskjellige separasjonene brukes for validering. Tredje kjørefelt, en negativ kontroll, representerer bakgrunn og viser at det er ingen autoflourescence i ge…

Discussion

Det er flere viktige trinn forbundet med Gel-seq apparat fabrikasjon samt protokollen. Under fabrikasjon anbefaler vi starter med de foreskrevne Sjikttykkelse for de ulike regionene i gel. Vi brukte betydelig tid tester forskjellige fabrikasjon alternativer og protokollen beskrevet her gir de beste enhetene for kassettene oppført i tabell av materialer og reagenser. Hvis forskerne bruker en alternativ kassett-system, kan de finne det nødvendig å justere volumene brukes ved opprettelse av enhetene. Den…

Materials

Reagents
Acrylamide Monomer	Sigma Aldrich	A8887-100G
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits	Kapa BioSystems	7959613001	Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)	Illumina	FC-131-1024	Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)	Takara/Clontech	634888	Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18	Sigma Aldrich	Z192554	Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769363	Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate – Corning HTS Transwell 96 well permeable supports – 8.0 µm pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system	ThermoFisher Scientific	EI0001	Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Referred to in the text as UV transilluminator
Ultrasonic Bath	Bransonic	1207K35	Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.