I denne artikel beskrives en metode til at analysere immun celleindhold af fedtvæv ved isolering af immunceller fra fedtvæv og efterfølgende analyse ved hjælp af flowcytometri.
Infiltrationen af immunceller i det subkutane og visceralt fedtvæv (AT) indskud fører til en lav-grade inflammation bidrager til udviklingen af fedme-associerede komplikationer såsom type 2-diabetes. Kvantitativt og kvalitativt undersøge immun celle subsets i menneskelige ved indskud, har vi udviklet en flow flowcytometri tilgang. De stromale vaskulære brøkdel (SVF), der indeholder immunceller, er isoleret fra subkutane og visceralt på biopsier af collagenase fordøjelsen. Adipocytter er fjernet efter centrifugering. SVF celler er farvet for flere membran-bundet markører valgt at skelne mellem immun celle subsets og analyseret ved hjælp af flowcytometri. Som følge af denne tilgang, pro – og anti – inflammatoriske makrofag delmængder, dendritiske celler (DCs), B-celler, CD4+ og CD8+ T-celler, og NK-celler kan påvises og kvantificeres. Denne metode giver detaljerede oplysninger om immunceller i på og mængden af hvert specifik undersæt. Da der findes talrige fluorescerende antistoffer, kan vores flow flowcytometri tilgang indstilles til at måle forskellige andre cellulære og intracellulære markører af interesse.
Fedme er kendetegnet hos lav-grade inflammation1 og infiltration af pro-inflammatoriske immunceller i både visceral og subkutane på (moms, sad). Ophobning af pro-inflammatoriske immunceller i momsen, der fører til insulinresistens, som er en primære risikofaktor for at udvikle type 2-diabetes2. Immunceller af både medfødte og adaptive immunsystem er fundet i den fede på, såsom makrofager, mastceller, neutrofiler, CD4+ og CD8+ T-celler og B-celler3,4,5,6 ,7. Disse immunceller, samt endotelceller, stromale celler, adipocyt progenitorceller, fibroblaster og pericytes, udgør SVF8 og er den vigtigste kilde til pro-inflammatoriske stoffer i på9.
VED inflammatorisk status er almindeligt undersøgt af teknikker, herunder vestlige skamplet10, qPCR11og Immunhistokemi11. Men når du bruger disse teknikker, hele ATT, adipocytter og SVF, bruges. Dette gør det vanskeligt at bestemme de beløb og delmængder af immunceller til stede ved. Immunceller har forskellige celle-markører til at definere og kategorisere dem, såsom makrofager. Makrofager viser signifikant heterogenitet i både funktion og celle overflade markør udtryk12. Derfor, de er ofte kategoriseret i to makrofag populationer: M1 og M2. M2 makrofager kaldes normalt alternativt aktiveret makrofager12,13 og opholde sig i på af lean, metabolisk normale mennesker14. Dog under fedme opstår en fænotypiske switch fra M2 makrofager at M1 makrofager. Disse aktiveret klassisk M1 makrofager express CD11C12 og akkumulerer omkring døde adipocytter at danne krone-lignende strukturer13. Det har vist sig at CD11C+ makrofager ved forringe insulin action og er associeret med insulinresistens i fede mennesker15. For at identificere M1 og M2 makrofager ved, er Immunhistokemi en mulighed. Denne teknik giver oplysninger om placeringen af makrofager i vævet. Dog vil det begrænse antallet af mærker, der kan bruges i en farvning. Derudover er det også vanskeligt at kvantificere. Derfor, for at undersøge de forskellige immun celle subsets i moms og lør indskud, har vi udviklet en flow flowcytometri tilgang. Denne tilgang giver os mulighed for at bruge flere markører pr. celle med ét flow flowcytometri analyse til at definere celle subsets og tælle antallet af hver delmængde i AT indskud.
Disse metoder beskriver, hvordan du isolere SVF fra moms og sad og kvantificere de relative mængder af immunceller i disse væv. Derudover oplyse metoderne sådan bestemme udtryk markører på specifikke celletyper.
Flowcytometri af væv immunceller er en kraftfuld teknik til fænotype immunologiske status for væv. Kvantificering af væv immunceller kan have mange programmer. Som beskrevet i resultaterne, er det muligt at sammenligne tilstedeværelsen af specifikke immunceller mellem grupper af patienter (fxlean vs fede). Derudover også udfører flowcytometri på blod af de samme patienter, kan sammenslutninger mellem cirkulerende celler og væv celler blive undersøgt. Med dette program kunne vi fastslå, at et bestemt undersæt af cirkulerende monocytter er tilknyttet pro-inflammatoriske CD11C+ fedtvæv makrofager16.
Justeringer til de beskrevne protokol vil udvide sine programmer som mange tilgængelige fluorescerende antistoffer gøre flowcytometri meget alsidigt. Med forskellige antistoffer kan skelnes mellem næsten alle celletyper og udtryk for mange markører kan påvises. Derudover er det muligt at plette markører intracellulært af permeabilizing cellemembranen for at tillade intracellulære binding af fluorescerende antistoffer. Disse egenskaber tillader sondring af de meget forskelligartede makrofag befolkninger ud over de alt for forenklet M1 og M2 makrofag undertyper. Ud over måling af overflade markør udtryk, kan proteiner (dvs., cytokiner) farves intracellulært giver oplysninger om makrofag funktionalitet. Derudover bruges spredning markører som Ki67 til at kvantificere spredning priser. Som beskrevet, var sondringen mellem makrofager og DCs baseret på MFI niveauer af DC markører. En generel makrofag markør, som CD68 kan indarbejdes i panelet makrofag (FACS panel 1). CD68 skal dog være plettet intracellulært kræver permeabilization af cellemembranen, som er ikke at foretrække og vil forlænge protokollen. Andre makrofag markører er undersæt markører som CD163 og CD206 eller CD11c, den sidstnævnte at blive integreret i panelet makrofag præsenteres her.
En markør for at skelne mellem levende og døde celler i vores FACS paneler, ikke var medtaget, som ville være at foretrække, fordi det giver mulighed for en mere præcis udelukkelse af døde celler end brugen af FSC og SSC. Hyppigt anvendte er DNA farvning levedygtighed farvestoffer propidium Iodid (PI) eller 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) samt og gratis Amin reagerer farvestoffer såsom LIVE/døde Fixable døde celle pletten Kit, som er tilgængelig i forskellige farve farver. Dog kan ikke PI og DAPI anvendes ved fastsættelsen af cellerne. Som beskrevet i protokollen, kan LIVE/døde Fixable Red Dead celle levedygtighed farvning integreres i begge paneler uden at påvirke den overordnede FACS gating strategi.
Desuden er dataene, der udtrykt som en procentdel af levende celler, hvilket betyder, at alle data er relativ. Kun ved at indtaste en nøjagtig, ville kendt antal celler i flow forskellige, det være muligt at bestemme de nøjagtige tal for hver celle. En omtrentlig antal celler kunne beregnes efter tælle celler i SVF-fraktionen ved hjælp af en optælling kammer. Dette tal skulle justeres for den biopsi væv bruges til at isolere SVF, men det har begrænsninger, når man sammenligner lean til overvægtige på. En lignende masse fede AT består af mindre adipocytter da de er fyldt med lipider og har udvidet betydeligt. Dette kunne føre til en undervurdering af immun celle nummer hvis præsenteret som antallet af immunceller pr. gram på eller adipocyt.
I humane undersøgelser, er inklusion af patienter normalt gøres over en længere periode at foretage standardisering af eksperimentelle procedurer af stor betydning. Til sammenligning af flow flowcytometri data mellem patienter er der flere muligheder. Som beskrevet i denne protokol, kan der fastsættes celler før måling giver mulighed for analyse af flere prøver på samme dag. Dette kan også opnås ved nedfrysning af SVF før farvning dem, som giver mulighed for at være lige mellem alle prøver farvning procedure, men levedygtigheden af celler kan blive påvirket. Endelig også ansat i denne undersøgelse, er fluorescerende perler at installere kompensationsniveauer, og forskellige tracking perler blev brugt bi-ugentlige for at standardisere daglige målinger af forskellige. Denne sidste mulighed er den mest effektive når måling prøver fra en undersøgelse, der spænder over en lang periode.
En begrænsende faktor for flowcytometri er generelt brugen af fluorescens. Antallet af fluorescerende etiketter, der kan registreres samtidigt er begrænset på grund af overlapning i emission spektre. Med smart FACS panel udvikling og brug af flere antistof cocktails pr. moms eller sAT prøven, kan der dog overvindes et dette spørgsmål, som beskrevet i denne protokol. Et vigtigt aspekt af FACS panel udvikling er FMO kontrol. Ved hjælp af alle antistoffer af panelet med undtagelse af en, kan blive værdsat potentielle autofluorescence niveauer, når man sammenligner FMO med panelet fuld. Dette giver mulighed for nøjagtig gating af befolkninger og disse procedurer bør udføres, når du opretter en ny FACS panel. Derudover kan nye generationer af FACS enheder registrere op til 50 parametre tillader samtidig registrering af mange egenskaber pr. celle. Et andet spørgsmål vedrører fluorescens aspekt er autofluorescence af celler, især makrofager. Efter excitation af celler med FACS laser (hovedsagelig med 488 nm bølgelængde excitation), disse celler udsender en fluorescerende signal (hovedsagelig < 640 nm) at kan overlapning med emission spektre af antistoffet etiketter17,18. For at tage hensyn til dette, bør unstained celler måles for at bestemme autofluorescence i hver kanal. Med denne viden, skal være markeret fluorokromer, der viser en signalstyrke, der overstiger autofluorescent signalet. Denne autofluorescent baggrund signal bør tages i betragtning ved fastsættelsen af den gating strategi for befolkningerne. Ved anvendelse af denne protokol og intelligent FACS panel design er det derfor muligt at i dybde fænotype makrofag undertyper. Nye særskilte AT makrofager og deres funktion kan karakteriseres.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke J. van de Gaar og M. Vroomen (Maastricht Universitet, Holland) for deres tekniske support. Derudover vil vi gerne takke K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, og E. Blaak for at give blod og væv biopsier bruges til oprettelse af denne protokol og de efterfølgende forsøg.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |