Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

Summary

Questo protocollo permette al lettore di analizzare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici usando un approccio sfaccettato per catturare la natura dinamica del biofilm batterici valutando l’aderenza, formazione di matrice extracellulare sostanza polimerica, e dispersione.

Abstract

Formazione di biofilm è un processo dinamico, multistadio che avviene nei batteri in condizioni ambientali difficili o periodi di stress. Per gli agenti patogeni enterici, una risposta di stress significativo è indotta durante il transito gastrointestinale e all’esposizione di bile, un normale componente di digestione umana. Per superare gli effetti battericidi di bile, molti agenti patogeni enterici formano un biofilm supposto per consentire la sopravvivenza durante il transito attraverso l’intestino tenue. Qui presentiamo metodologie per definire la formazione di biofilm tramite analisi di fase solida adesione così come rilevamento di matrice extracellulare sostanza polimerica (EPS) e la visualizzazione. Inoltre, valutazione di dispersione di biofilm è presentato per imitare l’analisi degli eventi provoca il rilascio di batteri durante il processo di infezione. Colorazione viola di cristallo viene utilizzato per rilevare batteri aderenti in un’analisi di aderenza ad alta velocità piastra a 96 pozzetti. Valutazione di produzione di EPS è determinato da due saggi, vale a dire la microscopia macchiatura della EPS matrice e analisi semi-quantitativa con una lectina legante il polisaccaride coniugato fluorescente. Infine, dispersione di biofilm è misurata attraverso Colonia conteggi e placcatura. Dati positivi da saggi multipli supportano la caratterizzazione di biofilm e possono essere utilizzati per identificare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in altri ceppi batterici.

Introduction

Formazione di biofilm è una strategia di sopravvivenza batterica importante indotta durante condizioni ambientali difficili. L’esposizione ai composti battericide come antibiotici o cambiamenti di sostanza nutriente o disponibilità di ossigeno induce uno stato sollecitato nei batteri che possono essere alleviati attraverso la formazione di biofilm. Un biofilm è caratterizzato da batterica allegato ad una superficie o altri batteri ed è accompagnato dalla secrezione di una matrice EPS composta principalmente da polisaccaridi^1,2,3. Formazione di biofilm è un processo dinamico, in cui una cascata di eventi culmina nella formazione di una comunità batterica aderente matura^1,2,3. I batteri producono adesine per facilitare il collegamento iniziale mentre spostando adesina profili di espressione genica per rafforzare allegato durante la maturazione del biofilm. Simultaneamente, produzione di EPS avviene a cappotto della comunità batterica in una matrice a proteggere le cellule dal fattore di sforzo iniziale. I batteri contenuti all’interno del biofilm sono a crescita lenta; e come tale, rende la maggior parte degli antibiotici inefficaci. Inoltre, la lenta crescita conserva l’energia fino a quando le condizioni cambiano per favorire la crescita batterica^1,2,3. Dopo aver passato le dure condizioni, batteri disperdono il biofilm e riprendere un stile di vita planctonico^1,2,3. Tradizionalmente, i biofilm sono osservati sulle superfici e rappresentano una sfida clinica persistente a causa di serbatoi di infezione presente su cateteri e dispositivi di in-abitazione^1,2,3.

Formazione di biofilm recentemente è stato descritto per parecchi agenti patogeni enterici; batteri che infettano il piccolo intestino o del colon⁴. Per specie Shigella , l’infezione si verifica nel colon umano dopo un transito attraverso la maggior parte del tratto gastrointestinale. Durante il passaggio attraverso l’intestino tenue, Shigella è esposto alla bile; un detergente del lipido-degradanti secernuto nell’intestino per facilitare la digestione dei lipidi mentre simultaneamente uccidendo la maggior parte dei batteri⁵. Patogeni enterici hanno una capacità unica di resistere agli effetti battericidi di bile⁶. La nostra analisi recenti utilizzati in vivo-come combinazioni di glucosio e sali biliari per dimostrare la formazione di biofilm robusto in S. flexneri , nonché altre specie di Shigella, patogeni di Escherichia colie Salmonella⁴. In precedenza, serovar di Salmonella enterica Typhi è stato indicato per formano un biofilm indotta da bile a causa di colonizzazione unico della cistifellea durante l’infezione cronica^{7,8,9, 10}. Inoltre, previa ricerca con Vibrio¹¹e Campylobacter¹² ha dimostrato la formazione di biofilm in risposta alla bile. Di conseguenza, le analisi estese le osservazioni di formazione di biofilm bile-indotta di altri agenti patogeni e contribuiscono a stabilire la dimostrazione di una risposta di agente patogeno enterico conservata alla bile. A differenza di biofilm cronico in cui trascrizione genica batterica è limitato e senescenza cellulare può verificarsi^1,2,3, proponiamo che il biofilm enterico bile-indotta è più di natura transitorio. Questo transitorio, virulento biofilm è caratterizzato da un rapido smontaggio (come visto nell’analisi della dispersione) e ha migliorato l’espressione di gene di virulenza osservato in biofilm popolazione^4,6. 

Come formazione di biofilm è un processo dinamico e poliedrico e l’uso dei sali di bile come un fattore d’inizio è stato solo recentemente descritto per patogeni enterici più, gli strumenti e le tecniche utilizzate sono applicazioni uniche e creative dei metodi tradizionali. Così, qui presentati sono gratuite tre strategie per quantificare le diverse caratteristiche importanti della formazione di biofilm indotta da sali biliari, inclusa l’adesione batterica, produzione della matrice EPS e dispersione di batteri vitali dal biofilm. Queste tecniche sono state utilizzate principalmente per la ricerca con Shigella; e pertanto, la valutazione di altri patogeni enterici può richiedere ottimizzazione. Tuttavia, dati positivi da tutti i tre saggi supportano l’identificazione del biofilm e stabilire protocolli riproducibile per la formazione di biofilm indotta da sali biliari.

Protocol

1. preparazione dei reagenti Sali biliari medio: per preparare il brodo di soia triptico (TSB) contenente sali biliari 0,4% (peso/volume), risospendere 200 mg di sali biliari in 50 mL di TSB in autoclave. Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fare fresco medio settimanale.Note: I sali biliari ordinariamente utilizzati è una miscela di 1:1 di sodio colato e sodio desossicolato isolato dalle cistifellea ovine e bovina. Come dimostrato in precedenza4, la presenza di glucosi…

Representative Results

In Figura 1, formazione del biofilm è indotto nella maggior parte della crescita seguente testata sei patogeni enterici in media che contengono i sali biliari. Un aumento significativo nei batteri aderenti dopo esposizione di sali biliari è osservata in quasi tutti i ceppi testati. L’eccezione è ed Escherichia coli (CEEA); si noti, tuttavia, l’osservazione indotta del Δaaf mutante4. I risultati indicano …

Discussion

Analisi della formazione di biofilm è impegnativo a causa della natura dinamica del biofilm e la variabilità tra i ceppi, materiali, laboratori e le analisi. Qui, diverse strategie sono presentate per determinare la formazione di biofilm in patogeni enterici dopo esposizione di sali biliari con intuizione sperimentale fornito per promuovere la riproducibilità. Ci sono considerazioni aggiuntive per garantire la riproducibilità. Innanzitutto, si consiglia di eseguire almeno tre indipendenti esperimenti ciascuno con tri…

Materials

Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
Crystal Violet	Sigma	C6158-50
Concanavalin-A FITC	Sigma	C7642-10mg
Glucose	Sigma	G7021-1KG
Bile Salts	Sigma	B8756-100G
LB Agar	Sigma	L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile	Fisher	14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635-500
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear)	TPP	92696
Flat-bottomed 96-well plates (black)	Greiner Bio-One	655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear)	TPP	92424
Glass coverslips 12mm, round	Fisher	08-774-383
96-well plate reader	Spectramax
Flourescent plate reader	Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope	Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator	New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator	Thermolyne Series 5000