멀티-omic 토양 샘플의 분석을 위한 MPLEx 프로토콜
Summary
프로토콜은 동시에 하나의 토양 샘플에서 대사 산물, 단백질과 지질을 추출, 감소 샘플 준비 시간 허용 및 한정 된 수량으로 샘플의 멀티-omic 질량 분석 분석을 활성화에 대 한 제공 됩니다.
Abstract
질량 분석 (MS)-기반된 통합된 metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic (멀티-omic) 연구 우리의 능력을 이해 하 고 환경 및 생물 학적 시스템에서 미생물 지역 사회 특성을 변형 시키고 있다. 이러한 측정도 가장 복잡 한 토양 미생물 커뮤니티의 향상 된 분석 사용 하 고 있습니다 현재까지 알려진 복잡 한 미생물 시스템. 그러나 멀티-omic 분석,, 있다 샘플 준비 과제, 별도 기사는 일반적으로 매우 준비 시간과 필요한 샘플의 양을 증폭 각 omic 연구를 위해 필요 하기 때문. 이 한계를 해결 하기 위해 3-에서-1 방법 같은 토양 샘플에서 대사, 단백질, 지질 (MPLEx)의 동시 추출 용 매 기반 접근을 적응 하 여 만들었습니다. 이 MPLEx 프로토콜은 모두 간단 하 고 많은 샘플 유형에 대 한 강력한 복잡 한 토양 샘플의 한정 된 수량에 대 한 활용 하는 경우에 입증 되었습니다. MPLEx 메서드는 또한 크게 생물학과 환경 물결 따라 변화를 평가 하는 동안 각 미생물 커뮤니티의 구성원의 더 나은 이해를 얻기 위하여 필요한 급속 한 멀티-omic 측정을 사용할 수 있습니다.
Introduction
토양 미생물 지역 사회 평가 탄소 순환, 기후 변화를 이해 하기 위한 중요 한 의미를 갖는다. 그러나 최근 연구는 어려움을, 다양 한 토양 유형 microbiota에 대 한 시퀀스 게놈의 부족 및 감지 하는 단백질의 많은 것의 알 수 없는 기능 등을 강조 했다. 이러한 도전 결과1,,23현재까지 알려진 가장 복잡 한 미생물 지역 사회 토양 때문. 멀티-omic 분석, metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic 연구에서 결과 결합 하는 최근 미생물 존재, 동안에 더 큰 이해를 얻기 위해 수많은 토양 연구에서 구현 되었습니다. 때문에 환경 섭1,,45분자 변화에 대 한 포괄적인 정보를 얻는. 멀티-omic 연구와 함께 한 가지 문제는 질량 분석 (MS)-기반으로 metaproteomic, metabolomic, 및 lipidomic 측정은 일반적으로 각 omic MS 호환6,7 에 대 한 특정 추출 과정 필요 , 8 , 9.이 정확한 절차 확인의 구현을 매우 어렵거나 불가능 한 때 샘플의 한정 된 수량만 사용할 수. 이러한 과제는 우리 동시 대사 산물, 단백질 및 지질 추출 (MPLEx) 방법 작은 샘플 볼륨 또는 대 중을 사용 하 여 정확도 개선 하 고 제공 하는 모든 3 개의 분석에 대 한 빠른 샘플 준비 조사를 자극합니다 10. 데이트 하 고, 이러한 목표를 모두 달성할 수 있는 대체 토양 추출 절차가 필요 하지 않습니다.
글로벌 멀티-omic 단일 토양 샘플의 분석을 사용 하려면 클로 프롬, 메탄올, 물 분판 기반으로 하는 유기 용 매 추출 프로토콜 사용된10이었다. 이 메서드는 원래 총 지질 기사9,11 에 대 한 개발 및 최근에 단일 샘플12,13 에서에서 대사 산물, 단백질과 지질 동시 추출에 대 한 개정 했다 14,15,16,17,18,19,20,,2122, 23,,2425,26,27,28,29,30, 적은 샘플 수량을 사용 하 고 실험적 변화10. MPLEx 프로토콜에서 클로 프롬은 별개 조각으로 샘플 성분의 triphasic 화학 별거를 위한 기초를 제공 하는 물과 혼합할 수 있는. 최고 수성 단계 따라서 친수성 대사, 단백질 디스크 그리고 지질 층 하단 클로 프롬 단계 (그림 1)에서 다음을 포함 합니다. MPLEx 대부분 토양에 적용 될 때 미 립 자 파편 샘플링 튜브의 맨 아래에 축적 하 고 모든 레이어는 수집 된 후 삭제 될 수 있습니다. 그러나 각 토양 유형 다를 수,, 및이 탄 등 높은 유기 토양, 토양 파편 중간 계층에 샘플링 튜브의 바닥에 떨어지지 않습니다. MPLEx 1) 작은 샘플 양이 멀티-omic 분석, 2) 멀티-omic 기사 같은 샘플 감소에서 사용 될 수 있습니다와 같은 동일한 샘플에서 유형 여러 분자를 분리 하면 몇 가지 장점이 제공 전반적인 실험 가변성, 그리고 샘플의 3) 큰 숫자 높은 처리량 연구10훨씬 더 빨리 준비 될 수 있습니다. 함께 이러한 혜택은 토양 샘플 및 그들의 복잡 한 미생물 지역 사회를 평가 하기 위한 더 나은 측정 기능을 제공 하기 위한 중요 합니다.
Protocol
참고: 매우 젖은 토양 이전 효과에 손해 없이 추출 추출의 lyophilized 수 있습니다. 젖은 토양 또한 사용 될 수 있지만 특정 비율에 시 약을 추가할 때 고려해 야 합니다. 참고:이 좋습니다 추출, 두 50 mL 튜브 (최대 50 mL 튜브 당 10 g 토양) 사이 분할 한다 당 건조 한 토양 중량의 20 g을 사용 하 여. 추출 또는 사용 가능한 샘플에 따라 다름 아래로 확장할 수 있습니다. <p class="jove_co…
Representative Results
MPLEx 프로토콜은 캔자스 네이티브 대초원 토양 (Mollisol 토양)에서 분자를 추출 하는 데 사용 됩니다, triplicate 분석 3376 펩 티 드, 105 지질 및 102 극 대사 (모든 고유 식별)에 대 한 결과 제공. 반면 MPLEx 프로토콜 지질과 대사 산물12,13,14,15,,16<sup cl…
Discussion
그것은 특정 방법, 예를 들어 세포 단계, 적응 시킬 수 있다 그래서 모든 실험실 같은 사용 가능한 장비 해야한다 참고 해야 합니다. 그러나 여기 우리 사용 vortexing sonicating, 큰 50 mL 비드 때리는 사용 하 여 작동 합니다. Lyophilizer-105 ° C의 온도 수집기와 사용할 수 없는 경우 샘플 질소 스트림 아래 건조 수 있습니다. 또한 토양 유형을 크게 다르며 모래, 갯벌, 찰 흙,이 탄, 및 옥 토 (등), 포함 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
작가 네이 선 존슨 수치 준비에 그의 원조에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는 미국 에너지 부의 사무실의 생물학과 환경 연구 (게놈 과학 프로그램), 전환 (민트) 실험실 감독 연구 개발에 Microbiomes에 의해 투자 되는 팬-omics 프로그램에 의해 지원 되었다 퍼시픽 노스 웨스트 국립 연구소, 국가 연구소의 건강 국립 연구소의 환경 건강 과학 (R01 ES022190)에서 이니셔티브와 NIH (P42 ES027704). KEBJ는 R21 HD084788 개발 하 고 새로운 멀티-omic 추출 기법 검증 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에는 W. R. 윌 환경 분자 과학 실험실 (EMSL), 미상 국가 과학적인 사용자 시설 평화로운 북 서 국립 연구소 (PNNL)에서 수행 되었다. PNNL은 Battelle 계약 드-AC06-76RL01830에서 DOE에 대 한 운영 하는 멀티 프로그램 국립 연구소 이다.
Materials
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250×4.6 mm, 5 μM with 4.6×20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V | |
References
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Cite This Article
Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343, doi:10.3791/57343 (2018).