Mit Terminal-Transferase-vermittelten dUTP Assays Nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) und Caspase 3/7 Maßnahme epidermalen Zelltod in Frösche mit Chytridiomykose
Summary
Wir quantifizieren epidermalen Zelltod in Frösche mit Chytridiomykose mit zwei Methoden. Erstens verwenden wir terminal Transferase-vermittelten dUTP Nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) in Situ Histologie Unterschiede zwischen klinisch infizierten und nicht infizierten Tieren feststellen. Zweitens führen wir eine Zeitreihenanalyse der Apoptose über Infektion mit einem Caspase 3/7-Protein-Analyse.
Abstract
Amphibien sind weltweit einen großen Verlust an biologischer Vielfalt erleben und eine der Hauptursachen ist der ansteckenden Krankheit Chytridiomycosis. Diese Krankheit wird verursacht durch pilzliche Erreger Batrachochytrium Dendrobatidis (Bd), infiziert und stört die Frosch Epidermis; krankhafte Veränderungen waren jedoch nicht explizit gekennzeichnet. Apoptose (programmierter Zelltod) kann kann durch Krankheitserreger verwendet werden, um Schäden Wirtsgewebe, jedoch auch eine Host-Mechanismus der Resistenz gegen Krankheiten Erreger entfernen. In dieser Studie quantifizieren wir epidermalen Zelltod von infizierten und nicht infizierten Tieren mit zwei verschiedenen Assays: terminal Transferase-vermittelten dUTP nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) und Caspase 3/7. Mit Ventral, dorsal, und Oberschenkel Hautgewebe in der TUNEL-Test, wir beobachten Zelltod in der Epidermiszellen in Situ klinisch infizierter Tiere und Zelltod mit nicht infizierten Tieren mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu vergleichen. Um festzustellen, wie Apoptose Ebenen in der Epidermis verändern im Laufe der Infektion wir Fußspitze Proben vierzehntägig über einen Zeitraum von 8 Wochen zu entfernen, und mit einem Caspase 3/7-Assay mit extrahierten Proteine um Aktivität innerhalb der Proben zu quantifizieren. Mit Infektion Last korrelieren wir dann Caspase 3/7-Aktivität. Der TUNEL-Test eignet sich für die Lokalisierung der Zelle Tod in Situ, aber ist teuer und zeitintensiv pro Probe. Die Caspase 3/7-Assay ist effizient für große Stichproben und Zeit natürlich Experimente. Allerdings da Frosch Zehe Tipp Biopsien klein sind gibt es begrenzte Extrakt für Probe Standardisierung über Protein Quantifizierungsmethoden, wie der Bradford-Test zur Verfügung. Wir empfehlen daher, Schätzung Hautfläche durch fotografische Analyse der Zehe Biopsien zu vermeiden die Einnahme von Extrakten während der Probe Standardisierung.
Introduction
Amphibien erleben derzeit eine der größten Verluste der globalen Biodiversität irgendein Wirbeltier Taxa1. Eine wesentliche Ursache für diesen Rückgang ist die tödliche Haut Krankheit Chytridiomycosis, verursacht durch den Pilz-Erreger Batrachochytrium Dendrobatidis, Bd2. Der Erreger infiziert oberflächlich die Epidermis, die zu einer Störung der Funktion der Haut, was zu schweren Elektrolytverlust, Herzstillstand und Tod3führen kann. Verschiedenen potentiellen Wirt Abwehrmechanismen gegen Bd werden derzeit geprüft, wie antimikrobielle Peptide4,5, kutane Bakterienflora6, Immunzelle Rezeptoren7,8, und Lymphozyten Aktivität9,10. Jedoch untersuchen nur wenige Studien, ob epidermalen Apoptosis und Zelle Tod einen Immunmechanismus gegen diese tödliche Erreger ist.
Zelltod durch Apoptose (programmierter Zelltod) oder Nekrose (unprogrammed Tod), in der Epidermis kann eine Pathologie des Bd -Infektion sein. Bisherige Untersuchungen zeigen, dass Bd -Infektion Apoptose induzieren kann, weil Störungen der intrazellulären Kreuzungen beobachtet wird als Haut Explantaten Zoospore Überstände in-vitro-11. ausgesetzt sind Darüber hinaus degenerative epidermalen Veränderungen im Bd-infizierten Frösche sind mit Elektronenmikroskopie12,13beobachtet. Transkriptomischen Analysen deuten darauf hin, dass Apoptose Wege hochreguliert in infizierten Haut14 sindund Amphibien splenocyten Apoptose Wenn sie Bd Überstände in-vitro-15ausgesetzt sind. Trotz des wachsenden Geschäftsvolumens Anhaltspunkte dafür, dass Bd induzieren können Zelle Apoptosis und Host Tod in Vitro, in Vivo -Studien, die zu erkunden oder Apoptose, die Mechanismen durch das Fortschreiten der Infektion fehlen zu quantifizieren. Darüber hinaus ist unbekannt, wenn der Host Apoptose als defensive immun Strategie verwendet, um Bd Infektion zu bekämpfen oder Apoptose eine Pathologie der Krankheit ist.
In dieser Studie sollen wir epidermalen Zelltod und Apoptose in infizierten Tieren in Vivo mit zwei Methoden zu erkennen: Caspase 3/7 Protein Assay und terminal Transferase-vermittelten dUTP nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) in Situ Assay. Wie jedes Assay unterschiedliche Aspekte der Zelle Tod16erkennt, gemeinsam diese Methoden bieten ein umfassendes Verständnis der Mechanismen Zelltod beteiligt und gewährleisten ein exaktes Maß für die Wirkung. Die Caspase 3/7-Assay quantifiziert die Aktivität der Effektor Caspasen 3 und 7, die Quantifizierung der intrinsische und extrinsische Apoptosis Bahnen ermöglicht. Im Gegensatz dazu erkennt der TUNEL-Test DNA-Fragmentierung, hervorgerufen durch Tod Zellmechanismen einschließlich Pyroptosis, Apoptose und Nekrose17. Wir verwenden den TUNEL-Test, um die Lage des Zelltods innerhalb der Epidermis von klinisch infizierten und nicht infizierten Tieren mit drei verschiedenen Hautpartien zu untersuchen: der Rücken, die Venter und den Oberschenkel des Pseudophryne Corroboree. Diese Methode gibt die Lokalisation der Zelltod, sowie seiner Lage innerhalb bestimmten epidermalen Schichten zu unterscheiden. Dann benutzen wir die Caspase 3/7-Assay, eine Zeit-Serie Quantifizierung der Apoptose in eine 8-Wochen-Infektion im Litoria Verreauxii Alpinadurchzuführen. Wir nehmen Zehe Spitze Proben vierzehntägig von den gleichen Tieren und sind in der Lage, Krankheitserreger Infektion Last mit Caspase 3/7 Aktivität korrelieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir untersuchten epidermalen Apoptosis und Zelle Tod als ein möglicher Mechanismus der Pathologie der tödlichen Krankheit Chytridiomycosis oder einen Mechanismus der Resistenz gegen Krankheiten in Bd empfänglicher Arten. Wir haben zwei Methoden der Bewertung Absterben von Zellen in der Epidermis, TUNEL-Test zur in Situ epidermalen Zelle Tod Analyse und Caspase 3/7-Assay für die Überwachung der epidermalen Zelle Tod in den Fortschritt der Infektion. Wir fanden, dass Zelltod und Apoptose mit Infektio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei die folgenden Personen, die mit Tierhaltung und Datenerfassung unterstützt: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, N. Harney und T. Knavel; und M. Merces Unterstützung bei Dissektionen. Wir möchten auch danke M. McFadden, P. Harlow und Taronga Zoo für die Anhebung der L. v. Alpinaund G. Marantelli für die Anhebung der p. Corroboree. Wir danken F. Pasmans, A. Martel für Ratschläge, Apoptose-Assays, C. Constantine, A. Kladnik und R. Webb für Hilfe mit TUNEL-Test, und T. Emeto und W. Weßels für Hilfe mit Protokoll und Kit für Caspase 3/7-Assay. Dieses Manuskript und Protokoll ist adaptiert von Brannelly Et Al 2017 Peer J22.
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
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