С помощью dUTP трансферазы терминал-опосредованной Ник конце маркировки (TUNEL) и Caspase 3/7 Assays для измерения эпидермальный клеточной гибели лягушек с Chytridiomycosis
Summary
Мы количественно эпидермального клеточной гибели лягушек с chytridiomycosis, с использованием двух методов. Во-первых мы используем маркировки конце терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник (TUNEL) в situ гистология для определения различия между клинически инфицированных и неинфицированных животных. Во-вторых мы проводим анализ временных рядов апоптоза над инфекции с помощью анализа белка каспазы-3/7.
Abstract
Земноводные испытывают большие потери биоразнообразия во всем мире и одна из основных причин является chytridiomycosis инфекционных заболеваний. Это заболевание обусловлено грибкового патогена Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), который заражает и разрушает лягушка эпидермиса; Однако патологические изменения не характеризовались явным образом. Апоптоз (запрограммированная смерть клетки) может использоваться патогенами для повреждать ткани макроорганизма, но также может быть принимающей механизм болезни сопротивления для удаления патогена. В этом исследовании, мы количественно эпидермальных клеток смерть инфицированных и неинфицированных животных, с использованием двух различных анализов: терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник конце маркировки (TUNEL) и caspase 3/7. С помощью вентральных, спинной и ткани кожи бедра в TUNEL assay, мы наблюдаем мобильный смерти клетки эпидермиса в situ клинически зараженных животных и сравнивать гибель клеток с неинфицированным животных с помощью флуоресцентной микроскопии. Для того, чтобы определить, как изменить уровни апоптоз в эпидермисе течение инфекции мы удалить образцы мыс Совет недели над 8-недельного периода и использовать пробирного каспазы-3/7 с извлеченные протеины для количественной оценки деятельности в рамках образцы. Затем мы сопоставляем активность каспазы-3/7 с нагрузкой инфекции. TUNEL assay полезен для локализации клеток смерть на месте, но дорого и времени интенсивно на сэмпл. Assay каспазы-3/7 эффективен для больших выборок и времени курс экспериментов. Однако потому что маленькие лягушки мыс наконечник биопсии имеется ограниченный экстракт для выборки стандартизации через методы количественной оценки белков, таких как assay Брадфорд. Поэтому мы предлагаем оценки площади поверхности кожи через фотографического анализа мыс биопсий, чтобы избежать потребления экстракты во время выборки стандартизации.
Introduction
Амфибии в настоящее время испытывают один наибольшие потери глобального биоразнообразия любой позвоночных таксонов1. Главной причиной этих падений является фатальным кожи chytridiomycosis болезни, вызванные грибкового патогена Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. Возбудитель поверхностно заражает эпидермис, что может привести к нарушению функции кожи, что приводит к тяжелой электролита потери, инфаркт миокарда и смерти3. В настоящее время изучаются различные потенциал принимающей иммунные механизмы против Bd , например антимикробных пептидов4,5, кожный бактериальной флоры6, иммунных клеток рецепторов7,8, и активность лимфоцитов9,10. Однако несколько исследований изучить ли эпидермальный апоптоз и клеток смерть является механизм иммунитета против этого смертоносного возбудителя.
Патология Bd -инфекции может быть смерть клетки, apoptosis (запрограммированная смерть клетки) или некроз (незапрограммированным смерти), в эпидермисе. Предыдущие исследования свидетельствуют о том, что инфекция Bd может индуцировать апоптоз, потому что нарушения внутриклеточного соединения наблюдается, когда кожа эксплантов подвергаются zoospore supernatants в vitro11. Кроме того дегенеративные изменения эпидермиса в Bd-инфицированных лягушки наблюдаются с помощью электронной микроскопии12,13. Транскриптомики анализы показывают, что apoptosis пути upregulated в14инфицированных кожи, и амфибии splenocytes проходят apoptosis, когда они подвергаются воздействию Bd supernatants в vitro15. Несмотря на растущий объем доказательств, предполагая, что Bd может вызвать apoptosis и принимающей ячейки смерти в пробирке, в vivo исследований, которые изучить или количественно апоптоз, что отсутствуют механизмы через прогрессирование инфекции. Кроме того это неизвестно, если узел использует апоптоз как оборонительные иммунной стратегия борьбы с Bd инфекции, или если апоптоз патологии заболеваний.
В этом исследовании, мы пытались обнаружить смерть эпидермальные клетки и апоптоз в зараженных животных в естественных условиях с помощью двух методов: assay протеина каспазы-3/7 и терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник маркировки конце () в situ assay TUNEL. Как каждый assay обнаруживает различные аспекты смерти клетки16, вместе эти методы обеспечивают полное понимание механизмов, участвующих в смерти клетки и обеспечить точное измерение эффекта. Assay каспазы-3/7 дает количественную оценку деятельности эффекторных caspases 3 и 7, который позволяет количественной оценки как внутренние и внешние апоптоз пути. В противоположность этому TUNEL assay выявляет фрагментацию ДНК, которая вызвана механизмов смерти клеток, включая апоптоза, некроз и pyroptosis17. Мы используем TUNEL assay расследовать на месте гибели клеток в пределах эпидермиса клинически инфицированных и неинфицированных животных, с использованием трех различных кожи секций: спинку, Вентер и бедра корробори Ложные жабы. Этот метод определяет анатомические сайт гибели клеток, а также отличительные его расположение в пределах конкретных слоев эпидермиса. Затем мы используем пробирного каспазы-3/7 провести количественную оценку серии времени апоптоза на протяжении 8-недельного инфекции в Австралийские квакши verreauxii alpina. Мы принимаем образцы кончик пальца две недели от же животных и возможность соотнести возбудителя инфекции нагрузки с активность каспазы-3/7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы исследовали эпидермальный апоптоз и смерть клетки как потенциального механизма патологии chytridiomycosis смертельной болезнью или механизма болезни сопротивления в Bd восприимчивых видов. Мы использовали два метода оценки смерть клетки эпидермиса, assay TUNEL для в месте смерти анал…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим следующих людей, которые помогал с земледелия и сбора данных: D. Tegtmeier, C. де Йонг, J. Hawkes, K. Фоссену, S. Персиваль, м. Мак-Вильямс, L. Бертола, м. Стюарт, н. Харни и т. Knavel; и м. Merces для помощи с вскрытия. Мы также хотели бы поблагодарить M. McFadden, P. Харлоу и Таронга зоопарк для повышения л. alpinaи G. Marantelli для повышения P. корробори. Мы благодарим F. Pasmans, A. Martel для консультации по апоптоз анализов, C. Константин, а. Кладник и р. Уэбб для помощи с TUNEL assay, и т. Emeto и W. Weßels для помощи с протоколом и комплект для assay каспазы-3/7. Эта рукопись и протокол заимствован из Brannelly et al 2017 Коллегиального J22.
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
- Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
- Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
- Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
- Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
- Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
- Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
- Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
- Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
- Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
- Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
- Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
- Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
- Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
- Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
- Woods, A., Ellis, R. . Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).
- Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).
