Строительство синтетических Фаговые отображается ВСБ библиотеки с учетом разнообразия
Summary
Этот протокол описывает подробную процедуру на строительство библиотеки отображается Фаговые синтетических антитела с учетом разнообразия. Синтетические антитела имеют широкое применение от фундаментальных исследований для диагностики заболеваний и терапии.
Abstract
Ежегодно растет спрос на моноклональных антител (mAbs) в фундаментальных исследований и медицины. Гибридомной технологии был доминирующим методом развития МАБ начиная со своего первого доклада в 1975 году. Как альтернативная технология ФАГ методы отображения для развития МАБ становятся все более привлекательными, поскольку Humira, первым антителом, фаг производные и один из бестселлеров mAbs, был одобрен для клинического лечения ревматоидного артрита в 2002 году. Как не животного на основе технологии развития МАБ, фаг дисплей обходит иммуногенность антигена, гуманизации и животных обслуживания, которые требуются от традиционных гибридомной технологии на основе антител развития. В этом протоколе мы описываем метод для построения синтетических ФАГ отображается Fab библиотек с различий можно получить с одного электропорации 1010 9-10. Этот протокол состоит из: 1) электро компетентных клеток высокой эффективности подготовки; 2) добыча урацил содержащих одноцепочечной ДНК (дю ssDNA); 3) метод Канкел основе олигонуклеотида Направленный мутагенез; 4) электропорации и расчет размера библиотеки; 5) белка на основе A/Л энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для складывания и функциональное разнообразие оценки; и 6) анализ последовательностей ДНК разнообразия.
Introduction
mAbs имеют широкое применение, начиная от фундаментальных исследований для диагностики заболеваний и терапии. Начиная с 2016 года более чем 60 mAbs были одобрены Соединенных Штатов продовольственной и наркотиков администрации (АППМ) для клинического лечения аутоиммунных заболеваний, рака и инфекционных заболеваний в1,2.
В 1975 году Колер и Мильштейн сообщили, что техника для непрерывного поколения антител одного клоновых специфичности от клеточного источника называют «hybridomas» и этот метод впоследствии стать краеугольным камнем в медицине и промышленности3 ,4. Поколение mAbs этот метод требует различные шаги, в том числе производство антигена, мыши иммунизации, извлечения лимфоцитов B, слияния клеток B с миеломой клетки сформировать Бессмертный hybridoma клетки, клон выбор и для терапевтического применения, Гуманизация требуется избежать человеческих антител анти мыши (HAMA)4,5. Однако для этой технологии, антигены, включая токсины, патогенов и высоко сохраненных белков являются относительно неэффективными в провоцировании в vivo иммунный ответ для mAb производства5.
В 1978 году Хатчинсон et al. сообщили об использовании олигонуклеотида для прямого мутагенеза остатков в одноцепочечной бактериофага вирус6. В 1985 году Смит сообщила, что иностранные гена фрагменты могут сливается в рамке с гене шифруя протеин пальто Фаговые III и таким образом могут быть отображены на поверхности Фаговые без ущерба для его инфективности7. Эти новаторские работы заложили фундамент для последующего строительства библиотек ФАГ отображается антител в иммунной, наивно, и синтетические формы с форматами переменной фрагмент одной цепи (scFv) и антиген связывая фрагмент (ФАБ) для терапевтических МАБ развития8,9. С технической точки зрения ФАГ дисплей на основе антител развития предлагает дополнительный подход к развитию на основе гибридомной МАБ, которые могут помочь обойти ограничения, которые могут представлять некоторые антигены и гуманизации процесса гибридомной полученные антител часто требуют5. По состоянию на 2016 6 Фаговые дисплей производные mAbs были одобрены на рынке, включая Humira, один из самых успешных mAbs, используется для лечения ревматоидного артрита, и многие кандидаты Фаговые отображения полученных антител в настоящее время находятся на различных стадиях клинических расследование10.
Для иммунной и наивно Фаговые антитела библиотек, разнообразие взаимодополняемости определение регионов (CDR) в легких и тяжелых цепи является производным от природных иммунной репертуар (т.е., от клетки B). В противоположность этому разнообразие CDR-файлов в библиотеках антитела синтетических Фаговые полностью искусственный. Синтетические подходы к построению библиотеки обеспечивают точный контроль над дизайн последовательности разнообразия и предлагают возможности для механистический исследования структуры антител и функционировать11,12. Кроме того рамки для синтетических библиотек может быть оптимизирована до строительства библиотеки для облегчения вниз по течению, крупномасштабного промышленного развития11,12.
В 1985 году, Канкел сообщили одноцепочечной ДНК (ssDNA) на основе шаблона мутагенеза подход эффективно представить сайт направленных мутаций в бактериофага M1313. Этот подход был впоследствии широко используется для строительства ФАГ отображается библиотек. Химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК предназначена внести разнообразие в Fab CDR включены в phagemid с шаблоном позвоночника антитела. В этом процессе phagemid выражается в урацил содержащих ssDNA (дю ssDNA) и олигонуклеотиды отожженная на CDR и продлил синтезировать двуцепочечной ДНК (dsDNA) в присутствии Т7 ДНК-полимеразы и T4 ДНК лигаза. Наконец сгенерированный ds ДНК может быть введено в Escherichia coli электропорации.
Высокое разнообразие, фаг отображается библиотека строительство, электропорация высоковольтные двухкомпонентная смесь электро компетентных клеток и ковалентно закрытой круговой dsDNA (CCC-dsDNA) должен быть подготовлен тщательно. Сидху et al. изменения подготовки электро компетентных клеток и ДНК от традиционных методов и значительно улучшенная библиотека разнообразия14.
В этом протоколе мы описываем метод для построения синтетических ФАГ отображается Fab библиотек с различий можно получить с одного электропорации 1010 9-10. Рисунок 1 показывает обзор строительства библиотеки, в том числе: 1) электро компетентных клеток высокой эффективности подготовки; 2) добыча dU-ssDNA; 3) метод Канкел основе олигонуклеотида Направленный мутагенез; 4) электропорации и расчет размера библиотеки; 5) белок A/Л-на основе ELISA для складывания и функциональное разнообразие оценки; и 6) анализ последовательностей ДНК разнообразия. Штаммов, реагенты и оборудование, перечислены в таблице материала. Таблица 1 показывает установки реагента.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы построить высокое разнообразие, фаг отображается Fab библиотек, контроль качества контрольно-пропускные пункты необходимы для мониторинга различных этапов процесса строительства, включая компетентность электро компетентных клеток, качество dU-ssDNA шаблона, эффективность СТС dsDNA с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признательны д-р Фредерик Fellouse из Сидху лаборатории для критических замечаний Канкел в метод основан синтетических Fab Фаговые библиотека строительство. Авторы ценят миссис Алевтина Павленко и других членов из лаборатории Сидху за ценную помощь подготовки высокой эффективности электро компетентных клеток кишечной палочки и высокое качество dU-ssDNA. Эта работа была поддержана Национальный фонд естественных наук Китая (Грант №: 81572698, 31771006) для DW и ShanghaiTech университета (Грант №: F-0301-13-005) в лаборатории инженерной антител.
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
References
- Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
- Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
- Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
- Hutchison, C. A., et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Sidhu, S. S. . Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , (2005).
- Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
- Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
- Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
- Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
- Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
- Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
- Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
- Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
- Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
- Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
- Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. . Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 157-180 (2006).
- Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).
- Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?. Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
- Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
- Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
- Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
- Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics – the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).
