بناء بالعاثية الاصطناعية عرض مكتبة القوات المسلحة البوروندية مع التنوع مصممة
Summary
ويصف هذا البروتوكول إجراء مفصل لبناء مكتبة عرض بالعاثية جسم الاصطناعية مع التنوع مصممة. الأجسام الاصطناعية لها تطبيقات واسعة من البحوث الأساسية لتشخيص الأمراض والمداواة.
Abstract
يتزايد الطلب على الأجسام المضادة (مابس) في البحوث الأساسية والأدوية سنوياً. وكانت التكنولوجيا هيبريدوما الأسلوب السائد لتنمية الإنسان والمحيط الحيوي منذ تقديم تقريرها الأولى في عام 1975. كتكنولوجيا بديلة، بالعاثية عرض أساليب لتنمية الإنسان والمحيط الحيوي جاذبية متزايدة منذ حميرا، جسم بالعاثية المشتقة الأولى وواحد من مابس مبيعاً، وتمت الموافقة للعلاج السريري لالتهاب المفاصل في عام 2002. كما غير الحيوانية على أساس تكنولوجيا التنمية ماب، يتجاوز العرض بالعاثية مستضد الاستمناع وإضفاء الصبغة الإنسانية والحيوانية الصيانة المطلوبة من هيبريدوما التقليدية القائمة على التكنولوجيا جسم تطوير. في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة لبناء مكتبات القوات المسلحة البوروندية الاصطناعية عرضها بالعاثية مع التنوعات9-10 1010 يمكن الحصول عليها مع انهانسر واحد. ويتألف هذا البروتوكول من: 1) إعداد الخلية المختصة الكهربائية ذات الكفاءة العالية؛ 2) استخراج المحتوية على اليوراسيل واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (دو-ssDNA)؛ 3) الأسلوب كونكيل على أساس الطفرات الموجهة اليغنوكليوتيد؛ 4) انهانسر وحساب حجم المكتبة؛ 5) البروتين A/L-تعتمد المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (أليسا) للطي وتقييم التنوع الوظيفي؛ و 6) تحليل تسلسل الحمض النووي للتنوع.
Introduction
مابس لها تطبيقات واسعة تتراوح بين البحوث الأساسية لتشخيص الأمراض والمداواة. وحتى عام 2016، عليها مابس أكثر من 60 من “الولايات المتحدة للأغذية” وإدارة المخدرات (معايير) للعلاج السريري لأمراض المناعة الذاتية والسرطان والأمراض المعدية1،2.
وفي عام 1975، ذكرت كولر وميلشتاين تقنية لتوليد الأجسام المضادة التحديد الاستنساخ واحد من مصدر خلوية يشار إلى ‘هيبريدوماس’ وهذه التقنية مستمرة وأصبح فيما بعد حجر زاوية في الطب والصناعة3 ،4. جيل مابس بهذه الطريقة يتطلب خطوات مختلفة بما في ذلك إنتاج مستضد وتحصين الماوس، استخراج لمفاوية ب والانصهار ب الخلايا مع خلايا المايلوما لتشكيل خلايا هيبريدوما الخالد، اختيار استنساخ، والتطبيقات العلاجية، إضفاء الطابع الإنساني على مطلوب لتجنب البشرية الماوس المضادة الأجسام المضادة (حماة)4،5. لهذه التكنولوجيا، المستضدات بما في ذلك السموم ومسببات الأمراض ويحافظ على درجة عالية من البروتينات غير فعالة نسبيا في أحداث استجابة مناعية في الجسم الحي للإنسان والمحيط الحيوي الإنتاج5.
هوتشيسون et al. في عام 1978، عن استخدام اليغنوكليوتيد للطفرات مباشرة من رواسب في فيروس عاثية واحد-الذين تقطعت بهم السبل6. في عام 1985، أفاد سميث أن شظايا الجينات الأجنبية يمكن أن تنصهر في الإطار مع الجينات ترميز البروتين معطف بالعاثية الثالث، ويمكن عرض ذلك على السطح بالعاثية دون المساس العدوى7. هذه رائدة يعمل أرست أساسا للبناء اللاحقة جسم بالعاثية عرض المكتبات في السذاجة المناعية، وأشكال الاصطناعية مع تنسيقات جزء متغير سلسلة مفردة (سكفف) ويفتت مستضد ملزمة (القوات المسلحة البوروندية) للعلاج ماب التنمية8،9. من وجهة نظر تقنية، يقدم بالعاثية المستندة إلى عرض جسم تطوير نهج التنمية القائم على هيبريدوما ماب يمكن أن تساعد على الالتفاف على القيود التي يمكن أن تشكل بعض المستضدات مكملة وعملية إضفاء الطابع الإنساني على غالباً ما تتطلب الأجسام المضادة المستمدة من هيبريدوما5. اعتبارا من عام 2016، تمت الموافقة على 6 بالعاثية مابس المستمدة من العرض في السوق بما في ذلك حميرا، أحد مابس الأكثر نجاحا التي تستخدم للعلاج من التهاب المفاصل، وكثير من المرشحين المستمدة من عرض جسم بالعاثية حاليا في مراحل مختلفة من السريرية 10من التحقيق.
للمناعة والسذاجة مكتبات جسم بالعاثية، تنوع التكامل-تحديد المناطق (تقارير الإنجاز الموحدة) في سلسلة الخفيفة والثقيلة مشتق من مرجع المناعة الطبيعية (أيمن الخلايا باء). على النقيض من ذلك، تنوع تقارير الإنجاز الموحدة في مكتبات جسم بالعاثية الاصطناعية مصطنعة تماما. النهج الاصطناعية لبناء مكتبة توفر دقة السيطرة على تصميم التسلسل التنوع وتتيح فرصاً للدراسات الميكانيكية لهيكل جسم وتعمل11،12. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الأمثل إطارا لمكتبات الاصطناعية قبل بناء المكتبة المصب، تيسير التنمية الصناعية على نطاق واسع11،12.
في عام 1985، أفادت كونكيل نهج واحد-الذين تقطعت بهم السبل الطفرات التي تستند إلى قالب الحمض النووي (سدنى) استحداث الطفرات موقع الموجه إلى عاثية M13 كفاءة13. واستخدمت هذا النهج على نطاق واسع في وقت لاحق لتشييد المكتبات عرض بالعاثية. مركباً كيميائيا النوكليوتيد الحمض النووي تهدف إلى إدخال التنوع في “القوات المسلحة البوروندية تقارير الإنجاز الموحدة” تدمج فاجيميد مع قالب جسم العمود الفقري. في هذه العملية، فاجيميد يتم التعبير عنها ك ssDNA المحتوية على اليوراسيل (دو-سدنى) والنوكليوتيد تعتيق على تقارير التنفيذ الموحدة والموسع لتوليف مزدوج تقطعت الحمض النووي (dsDNA) حضور بوليميراز الدنا T7 وليجاسي T4 الحمض النووي. وأخيراً، يمكن تقديم ds الحمض النووي الذي تم إنشاؤه في الإشريكيّة القولونية بواسطة انهانسر.
للتنوع الكبير، وبناء مكتبة عرض بالعاثية، انهانسر الفولت العالي من خليط المكون الثاني من الخلايا الكهربائية المختصة وتساهمي دسدنا دائرية مغلقة (CCC-دسدنا) ينبغي أن تعد بعناية. تعديل سيدهو et al. لإعداد الخلايا الكهربائية المختصة والحمض النووي من الأساليب التقليدية والمكتبة إلى حد كبير تحسين التنوع14.
في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة لبناء مكتبات القوات المسلحة البوروندية الاصطناعية عرضها بالعاثية مع التنوعات9-10 1010 يمكن الحصول عليها مع انهانسر واحد. ويبين الشكل 1 نظرة عامة لبناء مكتبة بما في ذلك: 1) إعداد الخلية المختصة الكهربائية ذات الكفاءة العالية؛ 2) استخراج دو-سدنى؛ 3) الأسلوب كونكيل على أساس الطفرات الموجهة اليغنوكليوتيد؛ 4) انهانسر وحساب حجم المكتبة؛ 5) البروتين A/L المستندة إلى أليسا للطي وتقييم التنوع الوظيفي؛ و 6) تحليل تسلسل الحمض النووي للتنوع. يتم سرد كافة الكواشف وسلالات والمعدات في الجدول للمواد. ويبين الجدول 1 الإعداد كاشف.
Protocol
Representative Results
Discussion
بناء عالية التنوع، عرض بالعاثية مكتبات القوات المسلحة البوروندية، ومراقبة الجودة يتطلب نقاط التفتيش لرصد المراحل المختلفة لعملية البناء، بما في ذلك كفاءة الخلايا الكهربائية المختصة، ونوعية القالب دو-سدنى، كفاءة مجلس التعاون الجمركي-دسدنا التوليف، عيار بعد انهانسر، والقوات المسلحة ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نقدر الدكتور فريدريك فيلوسي من مختبر سيدهو للتعليقات الانتقادية كونكيل للأسلوب على أساس بالعاثية القوات المسلحة البوروندية الاصطناعية بناء المكتبة. الكتاب نقدر السيدة اليفتينا بافلينكو وأعضاء آخرين من مختبر سيدهو لمساعدة قيمة من إعداد المختصة الكهربائية ذات الكفاءة العالية كولاي الخلايا وعالية الجودة دو-سدنى. هذا العمل تدعمه “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية” (منحة رقم: 81572698، 31771006) إلى جاف ومن جامعة شانغايتيتش (رقم المنحة: و-0301-13-005) إلى “مختبر لجسم الهندسة”.
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
References
- Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
- Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
- Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
- Hutchison, C. A., et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Sidhu, S. S. . Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , (2005).
- Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
- Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
- Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
- Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
- Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
- Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
- Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
- Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
- Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
- Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
- Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. . Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 157-180 (2006).
- Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).
- Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?. Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
- Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
- Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
- Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
- Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics – the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).
