Mikromanipulation kromosomer i insekt spermatocyter

Summary

I detta protokoll beskriver vi urval och förberedelse av lämpliga celler för mikromanipulation och användning av en piezoelektrisk micromanipulator att flytta kromosomer i dessa celler.

Abstract

Mikromanipulation kromosomer har varit en viktig metod för upplysande mekanismen för kromosom congression, spindel checkpoint och Anaphasen kromosom rörelser, och har varit nyckeln till att förstå vad som styr kromosom rörelser under en celldelning. En skicklig biolog kan använda en micromanipulator för att lossa kromosomer från spindeln, flytta kromosomer i cellen, och att tillämpa styrkor till kromosomer med ett litet glas nål med en mycket fin spets. Medan störningar kan göras till kromosomer med andra metoder såsom optiska svällning och andra användningar av en laser, hittills, tillåter ingen annan metod ompositioneringen av cellulära komponenter på skalan av tiotals till hundratals mikrometer med liten eller ingen skada på cellen .

Urval och förberedelse av lämpliga celler för mikromanipulation kromosomer, som specifikt beskriver utarbetandet av gräshoppa och cricket spermatocyte primära cellkulturer för användning i live-cell imaging och mikromanipulation, är beskrivs här. Dessutom visar vi byggandet av en nål användas för flyttar kromosomer i cellen, och användning av en joystick-kontrollerade piezoelektriska micromanipulator med ett glas nålen bifogas det flytta kromosomer inom delande celler. Ett provresultat visar användningen av en micromanipulator att lösgöra en kromosom från en spindel i en primär spermatocyte och flytta den kromosomen inom cellen.

Introduction

Mikromanipulation har avslöjat delar av mekanismen för en kromosom congression, spindel checkpoint och Anaphasen kromosom rörelser. Den tidigaste publikation som beskriver resultaten av mikromanipulation experiment var av Robert Chambers¹. Chambers används en mekanisk micromanipulator med en bifogad glas nål sond cytoplasman i ett antal olika celltyper. Tyvärr, kontrast metoder som tillät visualisering av kromosomer och många andra cellulära komponenter i levande celler inte var tillgängliga vid tiden så Chambers experiment inte kunde Visa effekterna av ompositionering sådana cellulära komponenter. Tidig micromanipulations som förändrade kromosomen position används Chambers apparaten för att sopa den spindeln midzone i Anaphasen celler, visar att sådana manipulationer kan ändra positionen för kromosom armar i Anaphasen gräshoppa neuroblasts² . Nicklas och hans medarbetare var först att utföra fina micromanipulations av kromosomer, stretching kromosomerna³, du lossar dem från spindeln och förmå en omorientering^3,4, stabilisera en malorientation av spänning för kromosomerna^5,6,7, och mäta de krafter som produceras av spindlar i Anaphasen^8,9. Annat arbete av Nicklas lab visade att cytoplasmiska korn också kan vara manipulerade¹⁰ och att centrosomes skulle flyttas av mikromanipulation¹¹. Mikromanipulation är inte bara användbart för att flytta kromosomer och andra cellulära komponenter. En mikromanipulation nål renlig kan skära genom en mitotiska spindeln i demembranated celler¹² eller kan användas för att upplösa den nuclear envelope¹³. Intilliggande celler kan dessutom vara smält av mikromanipulation^14,15.

Med ett så brett utbud av intressanta experiment som kan göras med mikromanipulation är det vid första anblicken förvånande att mikromanipulation experiment har gjorts av mycket få kromosom biologer. En orsak till denna brist är att de mitotiskt dividera odlade celler som härrör från ryggradsdjur vävnader och används ofta för att studera kromosom rörelser är extremt svåra att micromanipulate. Dessa vävnadsodling celler har i allmänhet en kortikal cytoskelettet att ”kommer i vägen” av mikromanipulation nål, och kromosomerna antingen inte kan nås av nålen eller nålen slipar igenom cellen, vilket leder till en cell bristning och döden. Vi och andra praktiker som använder mikromanipulation, har hittat leddjur celler att vara mottagliga för mikromanipulation. Leddjur spermatocyter sprids lätt under ett lager av halocarbon olja och verkar ha en mycket mindre robust kortikala cytoskelettet underliggande cellmembranet under en celldelning. Således, leddjur testiklarna ger en bra källa av meiotically-att dela upp celler (spermatocyter) och mitotiskt-att dela upp celler (spermatogonier) med lättillgängligt kromosomer för mikromanipulation. En seriell sektionering av en gräshoppa spermatocyte fast under en manipulation avslöjade att nålen aldrig tränger cellmembranet; cellmembranet deformerar runt nålen (Nicklas R.B., personlig kommunikation). Spermatocyter från ett antal insekt och spider taxa har varit micromanipulated framgångsrikt, inklusive gräshoppor, be mantids, bananflugor, crane flugor, syrsor, spittlebugs, nattfjärilar, svarta änkan spindlar, källare spindlar och orb-vävning spindlar ^{3,7,17,18,19,20,21,22}. Odlade, mitotiskt-att dela upp celler från insekter kan vara micromanipulated. Till exempel har kromosomerna i grasshopper neuroblasts i en primär kultur kromosomer som kan vara lätt micromanipulated^2,23. Vi misstänker att de tillgängliga odlade linjer härrör från Drosophila och andra insekter blir också micromanipulatable, men vi inte har testat tekniken med dessa celler. Vi visar hur delande celler från gräshoppor och syrsor kan förberedas för en mikromanipulation. Syrsor är lätt att få från de flesta djuraffärer som helst på året. Gräshoppor är bara enkelt kan erhållas i sommaren om forskaren har tillgång till ett laboratorium koloni, men de arter som används (Melanoplus sanguinipes) har lätt tillplattad celler och lång, lätt-till-manipulera kromosomer.

En annan orsak varför mikromanipulation experiment har gjorts av en liten handfull biologer är att micromanipulators som flyttar kromosomer väl är sällan tillgängliga i marketplace. Vi har funnit att en joystick-kontrollerade piezoelektriska micromanipulator styr nålen rörelsen med ingen vibration, drift eller eftersläpning mellan den joystick rörligheten och nål, men andra typer av manipulatorer kan också framgångsrikt driva kromosomer runt i cellen. De micromanipulators designad av Ellis och Begg^25,26 är idealiska för mikromanipulation kromosomer, även om de använder äldre teknik. Piezoelektriska micromanipulators är för närvarande tillgängliga och används ofta i elektrofysiologi; dessa micromanipulators är dock inte vanligtvis joystick-kontrollerade. Joystick kontroll är nyckeln till de mjuka rörelser som krävs för en lyckad mikromanipulation, och så en anpassad joystick bör utformas för att göra de nu befintliga piezoelektriska micromanipulators arbeta för en kromosom mikromanipulation. De joystick-kontrollerade piezoelektriska micromanipulators som fungerar bäst har direkt position kontroll, där rörelsen av joysticken översätter direkt till en nål rörelse.

En nydesignade piezoelektriska micromanipulator kan konstrueras från kommersiellt tillgängliga delar som lätt kan ersättas och några små 3D-utskrivna komponenter, och det fungerar bra för kromosom mikromanipulation²⁴. Micromanipulator har justerbar känslighet, manuell grov positionering, och inga vibrationer, drift eller lagg i nålen rörelsen och direkt position kontroll av nålen. Forskare kan konstruera den micromanipulator som använder instruktioner tillgängliga online²⁴. Nedan är metoderna för att förbereda en primär spermatocyte cellkultur och för micromanipulating kromosomer i cellerna i det kulturen.

Protocol

1. beredning av primära insekt Spermatocyte cellkultur för mikromanipulation Bild förberedelse Erhålla en 75 x 25 mm glasskiva med ett 20 mm diameter cirkulärt hål klippa ut i mitten av bilden.Obs: Dessa sänktes från ett enstaka pappersark fönsterglas till storleken av en glasskiva med ett hål i mitten. Kör en 25 x 25 mm #1.5 täckglas genom en Bunsen-brännare flamma för 2 s. Vakuum smörj runt kanten av hålet i glasskiva Placera täckglaset på hålet …

Representative Results

Figur 6 visar en prov mikromanipulation av 2 intilliggande gräshoppa primära spermatocyter i flera exempel på de möjliga användningsområdena för mikromanipulation. Detta experiment gjordes med hjälp av en inverterad, faskontrastmikroskop. 0:00 (gånger visas är i min:s) bilden visar båda cellerna före manipulering. En kromosom i cellen längst ned visas under spänning appliceras av mikromanipulation nålen (0:05; svart pil) och sedan helt friståe…

Discussion

Med övning, kan flyttar kromosomer i cellen bli en andra natur. Nålar som är tillräckligt styva och tillräckligt tunn spets är svårt att ”få knep för” fabricera, men denna förmåga kommer också med praktiken. Nålar som är så fina att de deformeras när flyttade i halocarbon oljan blir inte användbar för att driva kromosomer i cellen. Nålar som är så trubbig att deras tips är synliga och lika stora som 1/3 av en kromosom bredd (eller större) är mycket sannolikt att döda cellen. Skapandet av en n…

Materials

VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25×25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order–call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300