אנו מציעים הרחבה תא פרוטוקול על macroporous microcarriers ואת השימוש בהם כמערכת משלוח ב זלוף מגיב ביולוגי כדי להפיץ מטריצה רקמות decellularized. אנו גם כוללים טכניקות שונות כדי לקבוע התפשטות תאים ואת הכדאיות של תאים תרבותי על microcarriers. יתר על כן, נדגים את הפונקציונליות של התאים לאחר ביוריאקטור תרבויות.
הנדסת רקמות הינו תחום מבטיח, התמקדו בפיתוח פתרונות עבור הביקוש הגובר על רקמות ואיברים בנוגע למטרות השתלת. התהליך ליצירת רקמות אלה הינו מורכב, וכולל שילוב של סוגי תאים ספציפיים, פיגומים לגירויים פיזיים או ביוכימי כדי להנחות צמיחת תאים ובידול. Microcarriers מייצגים כלי מושך כדי להרחיב את התאים microenvironment תלת מימד (3D), מאז הם לספק גבוה משטח-יחסי נפח ומחקים באופן הדוק יותר המצב ויוו לעומת שיטות מסורתיות דו-ממדית. מערכת כלי הדם, הספקת חמצן וחומרים מזינים לתאי ולהבטיח פינוי פסולת, מהווה את אבן בניין חשובה בעת יצירת רקמות מהונדסים. למעשה, רוב המבנים להיכשל לאחר להיות מושתל עקב חסר תמיכה בכלי הדם. במחקר זה, אנו מציגים את פרוטוקול להרחבת תא אנדותל על microcarriers מבוססי קולגן רקומביננטי בתנאים דינמיים טווה את הבקבוק, ריאקטורים, נסביר כיצד לקבוע את הגדרת תא הכדאיות ופונקציונליות. בנוסף, אנו מציעים שיטה למסירה תא למטרות vascularization ללא ניתוק נוספים השלבים הנחוצים. יתר על כן, אנו מספקים אסטרטגיה כדי להעריך vascularization תא פוטנציאליים ב זלוף מגיב ביולוגי על מטריצה ביולוגי decellularized. אנו מאמינים כי השימוש בשיטות שהוצגו יכול להוביל לפיתוח טיפולים חדשים מבוססי תאים עבור מגוון גדול של רקמות יישומי בתרגול קליני הנדסה.
בעיה כללית אחת ביישומים הנדסת רקמות היא להניב מסה גבוהה תא עם פנוטיפ בידול הנכון במיקום של צריכה. היישום של microcarriers כדי לטפל בבעיה זו החלה בשנת 1967 עם הגדלת חשיבות לתאריך בתחומים כגון: הנדסת רקמות אורתופדי לייצור בקנה מידה גדול של עור, עצם, סחוס, גידים1. הם מאפשרים את הטיפול של תרבויות חסיד בדרכים דומה לזה של הבולם תרבויות2 על ידי הרחבת לתאים microscale תלת מימד (3D) סובסטרטים. ובכך התאים חווים היצע מזין הומוגנית ואינטראקציות תא מטריצה להוביל תחזוקה טובה יותר של ויוו3,בידול4 אשר לעיתים קרובות שאבדו עם הזמן בדו מימד מתקרב5. יחס גבוה יותר של השטח לבנפח – המוביל בסופו של דבר גבוה יותר תא התשואות6,7, גבוה יותר גז ושערי חליפין מזין השוואת מערכות סטטיות8, האפשרות לווסת ולהוריד נושא התרבות הפיזית גירויים9, ואת הפוטנציאל אולם שינוי קנה המידה של תהליך הרחבת7 הם עוד יתרונות. מספר תכונות כגון קוטר, צפיפות, נקבוביות, תשלום משטח הדבקה מאפיינים10,11 להבחין את שונים זמינים מסחרית מיקרו, מאקרו-מנושאות המטוסים שלו. עם זאת, אחד היתרון העיקרי הוא משלוח שלהם פוטנציאל microtissues האתר פגם או דרישה.
עבור יישומים של טכנולוגיית microcarrier בהנדסת רקמות העצם, אנחנו מאויר הדוח הקודם12 הייצור של microcarrier החדש סוג היוו של קולגן רקומביננטי אני פפטיד (RCP, זמינים מסחרית כמו Cellnest). Microcarrier חדש זה מאפשר את GMP התואם את קנה המידה של ההפקה בפיגומים ותא, כנדרש לצורך מסירה תאים תרחיש קליני. בהקשר זה, כוונון של יציבות לגרדום, השפלה קצב ומאפיינים השטח באמצעות בחירה נכונה של אסטרטגיה מתאימה crosslinking מאפשר להתאים את הטכניקה כדי היישום שנבחר, תא סוג של ריבית או היעד רקמת13. בפרט, פוטנציאל להעסקת הזה microcarrier כמערכת משלוח תא להזרקה עבור יישום טיפולי14 גורם להם מעניין במיוחד בסביבה קלינית.
בנייר זה, אנחנו ולכן להמחיש את ההליך culturing הבידוד והרחבה של מח עצם, נגזר mesenchymal סטרומה תאים אנושיים (hBMSCs) ואת עורי microvascular אנדותל תאים אנושיים (HDMECs) על קולגן-אני מבוססי רקומביננטי microcarriers מבוססת על פפטיד, והכנתן למסירה בסביבה קלינית. יתר על כן, אנו מתארים פרוטוקולים נוספים שימושי לשם קיום התא הכדאיות על ההשתלה.
תא הכדאיות לאחר ההשתלה הוא למעשה תלויה בחום vascularization15,16,17, אשר מבטיחה חילופי חמצן וחומרים מזינים ואסטמה ומקילה על פינוי פסולת. אינקובטורים-מטלטל סיבובי מהווים גישה אחת להתגבר על אתגרים vascularization בהנדסת רקמות ולשמור על יכולת הקיום של התא, דרך זלוף בינוני תרבות ובכך מתן חמצן וחומרים מזינים18. כאן, אנו ממחישים שיטה במבחנה כדי להעריך את יכולת העברה של תאים אנדותל microvascular microcarriers RCP biomatrix ואת יכולתם לתרום vascularization דה נובו ואת אנגיוגנזה. Biomatrix הזה הוא קטע מעי צם חזירי decellularized הנקרא BioVaSc (ביולוגי Vascularized לגרדום), עשיר קולגן ואלסטין, עם לשימור מבנים כלי דם, אשר כולל עורק האכלה, המנקזים את הווריד19 כי כבר להחיל עבור בעיות השרשה20.
אחת המטרה העיקרית של microcarrier היא ההרחבה של תאים תוך שמירה על בידול שלהם על מנת להעביר תאים במקום הצורך. השיטה מייצגים מציגים RCP microcarriers שבו התאים היו מסוגלים לצרף להתרבות, ליישב את microcarriers עם צפיפות גבוהה התא. זה נצפתה על ידי חי/מת מכתים, שבו התגלו יותר מ 90% מכלל התאים קיימא ואילו רק כמה תאים מת?…
The authors have nothing to disclose.
המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מן האיחוד האירופי השביעי מסגרת תכנית האיחוד FP7/2007-2013 תחת גרנט הסכם n ° 607051 (ביו-השראה). אנו מודים וקרולין מדריכים סיורים במתחם ואן Spreuwel-גוסנס של Fujifilm ייצור Europe B.V., לקבלת סיוע טכני במהלך הייצור RCP, ורנר סטרקה ממוסד פראונהופר עבור סיליקט מחקר ISC, לקבלת סיוע בניתוח SEM.
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
Cellnest | Fujifilm | ||
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Peristaltic pump | Ismatec | ||
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |