골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성
Summary
여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.
Abstract
문화 monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC) Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)를 사용 하 여 마우스 골 수에서 생성 된의 최근 이전 감사 보다 더 이질적인 것 인정 되었습니다. 이러한 문화는 정기적으로 뿐만 monocyte 파생 된 moDC 대 식 세포 (moMac), 및 monocytes 등도 일부 덜 개발 된 셀 포함. 이 프로토콜의 목표는 일관 된 방법을 제공 식별 및 분리는 많은 종류의 세포가이 문화에 대 한 개발로 서 그들은, 특정 기능 추가 조사 될 수 있도록. 여기에 제시 된 정렬 전략 4 인구 둘 다는 표현 정도 세포에 의해 그들은 GM-CSF 중심 문화에서 개발 Ly6C 및 CD115의 식을 기반으로 먼저 세포를 분리 합니다. 이 4 개의 인구는 일반적인 골수성 창시자 또는 CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage 창시자 또는 GMP (Ly6C +, CD115-), monocytes (Ly6C +, CD115 +), 및 monocyte 파생 된 세포 또는 moMac (Ly6C-, CD115 +)를 포함합니다. CD11c는 Ly6C-, CD115-인구 내에서 두 개의 인구를 구분 하는 정렬 전략에도 추가 됩니다: CMP (CD11c-) 및 moDC (CD11c +). 마지막으로, 두 개의 인구는 Ly6C-, CD115 + 인구 MHC 클래스 II 식의 수준에 따라 내 더 구별 될 수 있습니다. MoMacs 익스프레스 MHC 종류 II, 더 낮은 수준의 높은 MHC 종류 II를 표현 하는 monocyte 파생 된 DC 전조 (moDP) 하는 동안. 이 메서드는 여러 발달 고유 인구 숫자의 신뢰할 수 있는 격리에 대 한 다양 한 기능과 발달 분석에 대 한 충분 한 있습니다. 우리는 하나 같은 기능 판독, 이러한 종류의 세포 차동 응답 Pathogen-Associated 분자 패턴 (PAMPs) 자극을 강조.
Introduction
Murine 골 수 세포는 사이토카인의 경작 Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)은 널리 이용 방법으로 큰 숫자 1, monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC;로 알려진 염증 DC)를 생성 하 2,3,,45. 이 세포의 수지상 세포 (DC) 함수 6,,78의 학문의 다양 한에서 매우 유용 되었습니다. 일반적으로, 이러한 murine 골 수 세포 교양 6-8 일 이며 수지상 세포 기능 5의 연구를 위해 사용 됩니다. 이러한 문화 오래 되어 고려 했다 주로 균질 성, 차별화 된 moDC의 대부분의 구성 된. 최근에, 그것은 분명이 6-8 일 문화 기간의 끝에, 차별화 된 monocyte 파생 된 세포 (moMacs) 9,,1011의 큰 하위 집합 뿐 아니라 실제로 많은 moDC 되었다. 우리 자신의 연구 더 적은 개발된 세포, monocytes, moDC 전 (moDP) 등의 다른 하위 집합 107 일 후에 낮은 주파수에서 문화에 남아 있는 것을 보여주는이 발견을 확대 했습니다. 따라서, 수지상 세포 (DC) 함수 사용 하 여이 시스템에 의해 생성 된 셀의 연구 이전 감사 보다 세포 유형의 광범위 한 코 호트의 응답을 반영 수 있습니다.
우리는 훌륭한 제의로 GM-CSF 생성 moDC 차별화 12,,1314의 마지막 단계에서 이러한 세포의 기능에 관련 된 연구에서 배웠습니다. 그러나, 우리가 이해 크게 이들의 발달 경로 대 한 세포 2,,1516 어떻게 그리고 언제 그들은 구체적인 전시의 같은 기능: 병원 체 관련 분자에 응답 패턴 (PAMPs), 식 균 작용, 항 원 처리 및 프레 젠 테이 션 13, 그리고 항균 활동. 기존의 Flt3L 기반 DC 창시자와 선구자의 많은 수의 격리 프로토콜 보고 17되었습니다. 이러한 고유한 인구의 격리 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE)를 사용 하 여 달성 되었다-스테인드 골 수 세포 (세포를 분할 추적)와 3 일 동안 Flt3L에 문화. 셀은 비재귀 긍정적인 세포의 고갈 그리고 조상과 전조 인구 CD11c 식 17을 기반으로 정렬 했다. GM-CSF 중심 문화에서 DC의 이른 창시자를 식별 하기 위해 Leenen의 그룹에 의해 또 다른 방법은 CD31 Ly6C 18에 따라 셀을 정렬 했다. 초기 목표는 창시자 및 GM-CSF 기반 moDC의 선구자는 비슷한 방법을 만드는 것 이었다. GM-CSF에 의해 생성 된 특정 세포 유형으로 인해 우리는 접근 및 전략 개발의 초기 및 이후 단계에서 표현 했다 분자의 식에 따라 정렬 적응. 우리가 궁극적으로 결정 하는 Ly6C, CD115 (CSF-1 수용 체), CD11c 10종류 구별이 셀에 대 한 최고의 마커를 했다.
여기, 우리 GM-CSF에 의해 구동 하는 차별화의 통로 따라 개발의 일부의 단계에서 세포의 분리 방법 제시: 일반적인 골수성 조상 (CMP), Granulocyte Macrophage 조상 (GMP), monocyte, monocyte 파생 된 대 식 세포 (MoMac) 및 monocyte 파생 된 DC (MoDC). MoMac 인구 수 추가 분리 될 기반 MHC 클래스 II 식의 수준에 moDC 전조 인구 (moDP) 10공개. 우리가 활용 고속 형광 활성화 셀이 5 인구 Ly6C, CD115, 및 CD11c의 식에 따라 분리 (FACS) 전략을 정렬 합니다. PAMP 자극에 대 한 답변을 공개 하는 기능 분석에서 이러한 셀의 시험 다음 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 GM-CSF 구동 시 조 및 전조 세포 유형 분석 생 화 확 적인 분석 실험, 세포 기능 시험관또는 주입 비보의 분석 실험 등의 여러 종류에 대 한 충분 한 숫자의 분리를 촉진 한다. 이 메서드는 신뢰할 수 있는 격리 및 식별이이 통로 그 차별화 된 셀 형식으로 개발의 초기에 셀의 더 일반적으로 사용 하는 monocyte 파생 된 모 수석 세포 개발의 분야에서 상당한 사전을 나타냅니다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 앨리슨 교회 새에 어 번 대학교 학교의 수의학 흐름 Cytometry 시설, 오 번 대학에서 분자 생물학 프로그램 및 휴대 하는 NIH에서 EHS R15 R15 AI107773 하 고 자금에 대 한 기술 지원에 대 한 감사 여름 연구 자금 PBR을에 대 한.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
