Een eenvoudige Stroom Cytometry gebaseerd Assay om te bepalen In Vitro antilichaam afhankelijk verbetering van Dengue Virus met behulp van de herstellende Serum Zika-Virus
Summary
Beschrijven we een eenvoudig en gemakkelijk protocol voor het meten van antilichaam afhankelijk verbetering van infectie door Zika virus herstellende serum met Dengue virus verslaggever virale deeltjes.
Abstract
Antilichaam afhankelijk verhoging van de infectie is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in Dengue virale pathogenese. Traditionele tests die meten van de capaciteit van antilichamen of serum om infectie in ontoelaatbaar cellijnen hebben vertrouwd op met behulp van virale uitvoer in de media gevolgd door plaque testen te kwantificeren van de infectie. Meer recentelijk hebben deze gehaltebepalingen Dengue virus (DENV) infectie in de cellijnen met behulp van fluorescently gelabelde antilichamen onderzocht. Deze beide benaderingen hebben beperkingen die het wijdverspreide gebruik van deze technieken beperken. Hier beschrijven we een eenvoudige in vitro -assay met Dengue virus verslaggever virale deeltjes (RVP) die uitdrukking geven aan groen fluorescent proteïne en K562 cellen te onderzoeken van antilichaam afhankelijk verbetering (ADE) van DENV-infectie met behulp van serum dat werd verkregen van rhesus Makaken 16 weken na infectie met Zika-virus (ZIKV). Deze techniek is betrouwbaar, minimale manipulatie van cellen gaat, gaat niet over het gebruik van live replicatie bevoegde virus en kan worden uitgevoerd in een hoge doorvoersnelheid formaat om een kwantitatieve uitlezing met behulp van stroom cytometry. Bovendien, kan deze bepaling gemakkelijk aangepast worden onderzoeken antilichaam afhankelijk verbetering (ADE) van andere flavivirus infecties zoals gele koorts-virus (YFV), Japanse Equine encefalitis virus (JEEV), West-Nijlvirus (WNV) etc. waar RVP beschikbaar zijn. Het gemak van het opzetten van de bepaling, de gegevens analyseren en interpreteren van de resultaten maakt het zeer vatbaar is voor de meeste instellingen van het laboratorium.
Introduction
Antilichaam afhankelijk verhoging (ADE) van de infecties is een proces waarbij gedeeltelijk cross-reactive antilichaam reacties veroorzaakt door een serotype van het virus verbetert de opname van een ander serotype van het virus, wat leidt tot meer virale replicatie en voorjaarsviremie. ADE is uitgebreid gedocumenteerd in Dengue virus (DENV) infecties waar vier belangrijke serotypen heersen. ADE is een subset van patiënten, gekoppeld aan Dengue hemorragische koorts (DHF). We hebben onlangs aangetoond dat Zika virus (ZIKV) infectie veroorzaakt aanzienlijk hoge niveaus van DENV cross-reactive antilichaam reacties die veroorzaakt ADE van DENV in vitro en waarschijnlijk bijgedragen aan de verhoging van de DENV voorjaarsviremie in vivo1 , 2. antilichaam-afhankelijke versterking testen zijn een waardevol instrument voor de beoordeling van de capaciteit van antilichamen te versterken van secundaire infectie met verwante virussen en bieden waardevolle inzichten in de pathogenese van flavivirus infecties en informeren de ontwikkeling van vaccins.
De assay beschreven gebruikt hier DENV RVP samen met K562 cellen, die normaliter ontoelaatbaar om infectie zijn. RVP zijn structureel intact replicatie incompetent DENV virale deeltjes die coderen van een sub-genomic groen fluorescente proteïne (GFP) replicon die na een ronde van replicatie3wordt uitgedrukt. Als zodanig, cellen die geïnfecteerd raken met RVP lichten groen op en kunnen gemakkelijk worden opgespoord met behulp van stroom cytometry of microscopie. De RVP gebruikt in deze test werden verkregen uit commerciële bronnen. Ze kunnen echter tegen andere virussen gegenereerd en gebruikt in de test die wordt beschreven in dit manuscript. K562 cellen zijn ondertussen een FcγIII-receptor-uiting geven aan leukemie cellijn die binden aan de Fc-regio van antilichamen en in het bijzijn van de concentraties van antilichaam4,5sub te neutraliseren besmet raken.
ADE testen zijn uitgebreid gebruikt in studies die onderzoeken de risicofactoren voor ernstige dengue en af te bakenen de mechanismen van in vitro ADE6,7,8. De bepaling van de ADE beschreven hier snel en eenvoudig inzetbaar om te bepalen van de capaciteit van het serum te versterken in vitro infectie met behulp van de RVP en stroom cytometry, in vergelijking met andere testen momenteel gebruikt waarvoor hetzij de bepaling van de vorming van tandplak eenheden (FPU) in Vero-cellen of het antilichaam kleuring van geïnfecteerde cellen6,7,8,9,10,11, die beide tijdrovend en arbeid zijn intensieve.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flavivirussen zoals DENV en ZIKV delen significante aanwijzingen dat de homologie in beide hun structurele en niet-structurele eiwitten die het genereren van antilichamen die met elkaar13,14 cross-react. Deze antwoorden cross-reactive antilichaam is aangetoond dat het verbeteren van besmetting zowel in vivo en in vitro met een heteroloog serotype of een andere gerelateerde flavivirussen1,2</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het beschreven project werd gesteund door fondsen van de Uniformed Services University van de gezondheidswetenschappen aan JJM. De adviezen of beweringen hierin zijn de privé van de auteurs en zijn niet te worden opgevat als officiële of reflecterende de standpunten van het Department of Defense, de Uniformed Services University van de Health Sciences of enige andere instantie van de VS Regering.
WGV alle experimenten uitgevoerd en analyseren van de gegevens; JJM ontworpen en begeleid de studie; WGW en JJM schreef het papier.
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
- Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
- Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
- Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
- Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
- Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
- Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
- Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
- Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
- Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
- Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).
