En enkel flödescytometri baserat test för att bestämma In Vitro antikropp beroende förbättring av denguefeber Virus använder Zika Virus konvalescent Serum
Summary
Vi beskriver ett enkelt protokoll för mätning av antikropp beroende förbättring av infektion av Zika virus konvalescent serum använder denguefeber virus Reporter viruspartiklar.
Abstract
Antikropp beroende förbättring av infektion har visat sig spela en stor roll i denguefeber viral patogenes. Traditionella analyser som mäter antikroppar eller serum förmåga att förbättra infektion i otillåten cellinjer har förlitat sig på hjälp viral utdata i media följt av plack analyser för att kvantifiera infektion. Dessa analyser har nyligen undersökt Dengue-virusinfektion (DENV) i cell linjer med fluorescently märkta antikroppar. Båda dessa synsätt har begränsningar som begränsar den utbredda användningen av dessa tekniker. Här, beskriver vi en enkel in vitro- analys med hjälp av denguefeber virus reporter viruspartiklar (RVP) som uttrycker grönt fluorescerande protein och K562 celler att undersöka antikropp beroende enhancement (ADE) av DENV infektion med serum som erhölls från rhesus makaker 16 veckor efter infektion med zikaviruset (ZIKV). Denna teknik är tillförlitlig, innebär minimal manipulation av celler, innebär inte användning av levande replikering behöriga virus och kan utföras i en hög genomströmning-format för att få en kvantitativ avläsning med flödescytometri. Dessutom kan denna analys enkelt anpassas för att undersöka antikropp beroende förbättring (ADE) av andra flavivirus infektioner såsom gula febern-virus (YFV), Japansk Equine encefalit virus (Emilia), West Nile-virus (Moskitbett) etc. där det finns RVPer. Lätthet att inrätta analysen, analysera data, och tolka resultaten gör det mycket mottagliga för de flesta laboratoriemiljö.
Introduction
Antikropp beroende förbättring (ADE) infektion är en process varigenom delvis korsa-reactive antikroppssvar som induceras av en serotyp av virus förbättrar upptaget av en annan serotyp av virus, leder till ökad virusreplikation och viremi. ADE har dokumenterats i stor utsträckning i denguefeber virus (DENV) infektioner där fyra större serotyper är utbredda. I en undergrupp av patienter är ADE associerad med denguefeber hemorragisk feber (DHF). Vi har nyligen visat att Zika-virusinfektion (ZIKV) inducerade betydligt höga nivåer av DENV korsa-reactive antikroppssvar som orsakade ADE av DENV in vitro och sannolikt bidragit till förbättringen av DENV viremi i vivo1 , 2. antikropp beroende enhancement analyserna är ett värdefullt verktyg att utvärdera kapaciteten hos antikroppar att förbättra sekundär infektion med relaterade virus och ger värdefulla insikter i patogenesen av flavivirus infektioner och informera den utveckling av vacciner.
Analysen beskrivs använder här DENV RVPer tillsammans med K562 celler som är normalt otillåten till infektion. RVPer är strukturellt intakt replikering inkompetenta DENV viruspartiklar som kodar en sub-genomisk grönt fluorescerande protein (GFP) replicon som uttrycks efter en omgång av replikering3. Som sådan, celler som smittats med RVPer fluorescerar i grönt och kan upptäckas lätt med hjälp av flödescytometri eller mikroskopi. De RVPerna som används i denna analys erhölls från kommersiella källor. Det kan dock vara genereras mot andra virus och används i analysen beskrivs i detta manuskript. Under tiden är K562 celler en FcγIII-receptor-uttryckande, leukemi cellinje som binder till Fc-delen av antikroppar och smittas i närvaro av sub neutraliserande koncentrationer av antikropp4,5.
ADE analyser har flitigt använts i studier som undersöker riskfaktorerna för svår denguefeber och att avgränsa mekanismerna av in vitro- ADE6,7,8. ADE analysen beskrivs här kan användas snabbt och enkelt att fastställa kapaciteten i serum för att förbättra in vitro- infektion med RVPer och flödescytometri, jämfört med andra analyser som används för närvarande som kräver antingen bestämning av plack bildas enheter (pfu) i Vero-celler eller antikroppar färgning av infekterade celler6,7,8,9,10,11, vilka båda är tidskrävande och labor intensiv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flavivirus som DENV och ZIKV dela betydande bevis för homologi i båda sina strukturella och icke-strukturella proteiner som genererar antikroppar som korsreagerar med varandra13,14. Dessa korsa-reactive antikroppssvar har visats öka av infektion både i vivo och in vitro- med ett heterologt serotyp eller andra relaterade flavivirus1,2. Potential att korsa förbättra infektion har bet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Beskrivs projektet stöddes av medel från Uniformed tjänster universitet vårdvetenskap till JJM. Åsikter eller påståenden som häri är de privata som av författarna och inte att tolkas som officiella eller reflekterande vyerna av Department of Defense, Uniformed tjänster universitet vårdvetenskap eller någon annan myndighet i USA Regeringen.
WGV utfört alla experiment och analyserade data; JJM utformade och övervakade studien; WGW och JJM skrev på papper.
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
- Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
- Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
- Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
- Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
- Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
- Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
- Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
- Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
- Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
- Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).
