High Throughput SiRNA Screening voor chloorpikrine en waterstoffluoride-geïnduceerde hoornvlies epitheliale cel letsel
Summary
Hoge-doorvoer kleine remmende RNA screening is een belangrijk instrument die helpen kan sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. Hierin presenteren wij de ontwikkeling en validatie van blootstelling modellen en methoden mbt de hoge doorvoer screening van waterstoffluoride en chloorpikrine-geïnduceerde hoornvlies epitheliale letsel.
Abstract
Oogbeschadigingen en/of letsel veroorzaken-geïnduceerde is een ware oogbeschadigingen en/of noodsituatie omdat chemicaliën de potentie hebben om snel belangrijke weefselschade toebrengen. Behandelingen voor hoornvlies letsel veroorzaken-geïnduceerde zijn over het algemeen ondersteunende omdat niet geen specifieke therapeutische middelen beschikken voor de behandeling van deze letsels. In de inspanningen voor de ontwikkeling van behandelingen en therapeutics zorg voor blootstelling, kan het belangrijk om te begrijpen van de moleculaire en cellulaire mechanismen van deze verwondingen. Wij stellen voor dat gebruik van hoge-doorvoer kleine remmende RNA (siRNA) screening kan een belangrijke tool die bijdragen kan aan het sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. siRNA zijn dubbele gestrande RNA molecules die 19-25 nucleotiden lang zijn en gebruik maken van het post-transcriptional gen silencing traject om te degraderen van mRNA die homologie aan siRNA hebben. De daaruit voortvloeiende vermindering van de expressie van de specifiek gen kan vervolgens worden bestudeerd in toxische blootgestelde cellen om na te gaan van de functie van dat gen in de cellulaire reactie op de veroorzaken. De ontwikkeling en validering van in vitro blootstelling modellen en methoden mbt de hoge throughput screening (HTS) van waterstoffluoride (HF) en chloorpikrine-(CP) geïnduceerde oogbeschadigingen en/of blessure worden gepresenteerd in dit artikel. Hoewel wij deze twee toxische stoffen geselecteerd, zijn onze methoden van toepassing tot de studie van andere toxische stoffen met kleine wijzigingen in het protocol van toxische blootstelling. Het grote T-antigeen van SV40 vereeuwigd menselijke hoornvlies epitheliale cellijn DIE SV40-HCEC werd geselecteerd voor de studie. Levensvatbaarheid van de cellen en de productie van IL-8 werden geselecteerd als de eindpunten in het protocol van de screening. Verschillende uitdagingen in verband met de ontwikkeling van toxische blootstelling en cel cultuur methoden geschikt voor HTS studies worden gepresenteerd. De oprichting van HTS modellen voor deze toxische stoffen voorziet in verdere studies om het mechanisme van letsel en scherm voor potentiële therapeutics voor chemische oogbeschadigingen en/of schade beter te begrijpen.
Introduction
Oogbeschadigingen en/of letsel veroorzaken-geïnduceerde is een ware oogbeschadigingen en/of noodsituatie omdat chemicaliën de potentie hebben om snel belangrijke weefselschade toebrengen. Behandelingen voor hoornvlies letsel veroorzaken-geïnduceerde zijn helaas alleen in het algemeen ondersteunende omdat niet geen specifieke therapeutische middelen beschikken voor de behandeling van deze letsels. De huidige strategie van de behandeling is niet-specifieke en hoofdzakelijk bevat actuele therapeutische behandelingen zoals smeermiddelen, antibiotica, en cycloplegics gevolgd door ontstekingsremmers (bijv., steroïden) eenmaal het hoornvlies heeft opnieuw epithelialized1 ,2. Ondanks de beste huidige therapeutische behandelingsopties beschikbaar is op lange termijn prognose over het algemeen slecht als gevolg van progressieve hoornvlies vertroebelt en neovascularization2,3.
Dierlijke modellen hebben van oudsher gebruikt chemische toxiciteit onderzoeken en begrijpen van de mechanismen van de schade. Dierproeven zijn echter tijdrovend en duur. Er zijn ook inspanningen ter vermindering van dierproeven. REACH-wetgeving (EG 1907/2006) in de Europese Unie heeft bijvoorbeeld bepalingen ter verminderen van dierproeven. De voorschriften omvatten een eis dat bedrijven gegevens delen teneinde dierproeven en goedkeuring van het Europees Chemicaliënagentschap voorafgaand aan het verrichten van voorgestelde proeven op dieren. Krachtens de bepalingen van REACH moeten de dierproeven een laatste redmiddel. Er is ook de Europese cosmetica-verordening (EG 1223/2009), die geleidelijk het testen van cosmetica op dieren. Wanneer dierproeven zijn uitgevoerd, zij worden geleid door de beginselen van 3V (verfijning, vermindering en vervanging), die een kader bieden voor het uitvoeren van meer humane dierlijk onderzoek, vermindering van het aantal proefdieren en het gebruik van proefdiervrije alternatieven waar mogelijk. Om deze redenen heeft het gebied van toxicologie willen aannemen in vitro testen die kunnen inzicht geven in de moleculaire mechanismen van toxiciteit en kunnen worden gedaan in de hogere doorvoer4. Dit is een functionele toxicologie benadering waar toxische stoffen worden gedefinieerd door hun functie in plaats van uitsluitend door hun chemie. Een stapje verder, functionele toxicogenomics proberen te begrijpen van de rol(len) die specifieke genen in de werking van toxische stoffen5 spelen. Met de toepassing van siRNA technologie, kunnen schermen te onderzoeken van de genfunctie in de moleculaire en cellulaire reacties op toxische stoffen worden gedaan met hoge doorvoersnelheid. siRNA zijn dubbele gestrande molecules van RNA die 19-25 nucleotiden lang die profiteren van de post transcriptionele gene silencing pathway aanwezig in alle cellen van zoogdieren6. Dit zijn synthetisch gemaakt en ontworpen om te richten van een specifiek gen. Wanneer een cel binnengebracht, siRNA wordt verwerkt en een strand, het strand van de gids, wordt geladen in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC). SiRNA stuurt de RISC naar een aanvullend gebied in een mRNA-molecuul en de RISC degradeert de mRNA. Dit resulteert in het terugdringen van de expressie van de specifiek gen. De daaruit voortvloeiende vermindering van de expressie van de specifiek gen kan vervolgens worden bestudeerd in toxische blootgestelde cellen om na te gaan van de functie van dat gen in de cellulaire reactie op de veroorzaken. Een dergelijke aanpak is verder inzicht in de mechanismen van ricine gevoeligheid en de AHR-afhankelijke inductie van CYP1A17,8gebruikt.
De lijst van chemische terrorisme Risk Assessment (CTRA) en de toxische industriële chemische stoffen (TIC) aanbiedingen hebben gespecificeerde select chemicaliën op basis van hun toxiciteit en potentieel tijdens een terrorist, oorlogvoering of arbeidsongeval gebeurtenis9worden vrijgegeven. We passen een siRNA hoge throughput screening (HTS) toxicogenomic benadering van de studie van CTRA lijst toxische stoffen, die zijn geïdentificeerd als hoog risico van gebruik in een terroristisch incident. Traditionele toxicologie tracht te begrijpen van de schadelijke effecten die chemicaliën op levende organismen hebben; we hebben echter een verdere verlangen om te begrijpen van de mechanismen van letsel met het oog op de ontwikkeling van therapeutics en therapeutische benaderingen, en eventueel ook te informeren ontdekken van moleculen die voor therapeutische ontwikkeling kunnen worden gericht. Deze inspanning in sommige opzichten kan vergelijkbaar met het gebruik van hoge-doorvoer siRNA screening en cellen gebaseerde testen in de drug discovery proces10worden beschouwd. Een groot verschil zou zijn dat drugontdekking meestal tot doel heeft een enkelvoud doel voor therapeutische ontdekking overwegende dat in onze aanpak is het enigszins onwaarschijnlijk dat er zou een enkelvoud doel met hoge therapeutische waarde voor de behandeling van toxische blootstelling. Wij verwachten dat elke effectieve behandeling paradigma voor toxische blootstelling zou vereisen een veelzijdige aanpak om te bereiken hoge therapeutische waarde, en toxicogenomic gegevens kan een effectieve behandeling paradigma vitaal in kennis stellen.
Benchtop automatisering brengt hoge doorvoer methodologie aan laboratoria buiten de farmaceutische of de biotech-industrie. De in vitro studies aan ons instituut geweest historisch traditionele testen die lage doorvoersnelheid11,12,13. Ons laboratorium heeft in de afgelopen jaren overgestapt naar het gebruik van benchtop robotica tot hoge doorvoer siRNA screening uit te voeren. Hierin presenteren we de verfijning van oogbeschadigingen en/of cel modellen en de ontwikkeling van in vitro blootstelling methoden voor waterstoffluoride (HF) en chloorpikrine (CP) geschikt voor hoge doorvoer siRNA screening. Ons doel is het identificeren van moleculen die regulering van cellulaire schade naar aanleiding van deze toxische stoffen. De doelstellingen van de bibliotheek van de siRNA die wij geselecteerd zijn G eiwit-gekoppelde receptoren, eiwit kinases, proteasen, fosfatasen genaamd, ionenkanalen en andere potentieel druggable doelen. HF en CP werden geselecteerd voor studie door kruisverwijzingen CTRA lijst agenten met de verslagen van de ToxNet van industriële ongevallen te vinden die het grootste risico van oogbeschadigingen en/of letsel via damp blootstelling9,14te presenteren. CP (chemische formule Cl3CNO2, CAS-nummer 76-06-2) werd oorspronkelijk gebruikt als een traangas in WWI15. Het wordt momenteel gebruikt als een agrarische fumigatiemiddel en functies als een insecticide, fungicide en nematicide16. Waterstoffluoride (HF) wordt gebruikt in processen zoals alkylatie in olieraffinaderijen en elektrochemische fluorering van organische stoffen17. HF (chemische formule HF, CAS-nummer 62778-11-4) is een gas, maar in de waterige vorm is fluorwaterstofzuur (HFA, CAS number 7664-39-3). Dus wij gekozen om HFA gebruiken in onze in cel blootstelling modellen. Het grote T-antigeen van SV40 vereeuwigd menselijke hoornvlies epitheliale cellijn DIE SV40-HCEC werd geselecteerd voor de studie. Levensvatbaarheid van de cellen en de inflammatoire IL-8-markering werden geselecteerd als de eindpunten omdat doelstellingen die bij cellulaire schade betrokken zijn moeten worden weerspiegeld in de dood van de cel en de ontstekingsreactie. In het bijzonder als een doelwit waren een beschermende rol te spelen in toxische blootstelling, moet celdood en/of inflammatoire cytokine productie verhogen wanneer de target-expressie door siRNA wordt geremd. Het omgekeerde zou gelden voor doelstellingen die een negatieve rol spelen. Ook lijkt chronische ontsteking een rol te spelen in de cornea pathologie na blootstelling, en de interventie in de cel dood wegen kan verbetering van klinische resultaten2,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin beschrijven we onze methoden en de resultaten op de ontwikkeling van een hoge doorvoersnelheid hoornvlies epitheliale cel screening model voor de studie van HF en CP verwondingen. Ook presenteren we de resultaten van het scherm van de primaire siRNA voor HF letsel. Er waren veel uitdagingen aan de ontwikkeling van HTS modellen voor de studie van TIC verwondingen. Methoden die we in de literatuur aan de studie van HF, HFA of CP in cel cultuur modellen gerelateerde vinden konden waren weinig hulp. Meeste in vitr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid tegengaan programma Interagency overeenkomst # AOD13015-001. Wij wil Stephanie Froberg en Peter Hurst bedanken voor hun inspanningen en expertise op videoproductie.
Materials
| Bravo liquid handing platform | Agilent or equivalent | G5409A | |
| Bravo plate shaker | Agilent or equivalent | Option 159 | |
| Bravo 96LT disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 178 | 96-channel large tip pipetting head unit |
| Bravo 96ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 177 | 96-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 384ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 179 | 384-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 96 250 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| EnSpire multimode plate reader | Perkin Elmer or equivalent | 2300-0000 | AlphaLISA assay detector with high power laser excitation |
| IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit | Perkin Elmer or equivalent | AL224F | no-wash bead-based assay |
| ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates | Perkin Elmer or equivalent | 6008359 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen or equivalent | 13778500 | Transfection reagent |
| Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium | Invitrogen or equivalent | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco or equivalent | 12605010 | Cell detachment solution |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments or equivalent | ESSEN BIOSCI 4473 | Incubator-housed automated microscope |
| Chloropicrin | Trinity Manufacturing or equivalent | N/A | Acute toxicity and irritant |
| DMEM-F12 cell culture medium | Invitrogen or equivalent | 11330-057 | Contains HEPES |
| Fetal bovine serum | Invitrogen or equivalent | 1891471 | |
| Human epidermal growth factor (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | E9644-.2MG | |
| Recombinant human insulin (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 12585-014 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 15140122 | |
| Hydrocortisone (cell culture grade) | Sigma or equivalent | H0888-10G | |
| Glucose (cell culture grade) | Sigma or equivalent | G7021 | |
| PBS (cell culture grade) | Sigma or equivalent | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon or equivalent | various | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma or equivalent | M5655 | MTT assay substrate |
| siRNA buffer | Thermo or equivalent | B002000 | |
| 96-well cell culture plates | Corning or equivalent | CLS3595 | |
| T150 cell culture flasks | Corning or equivalent | CLS430825 | |
| BSL-2 cell culture hood | Nuaire or equivalent | NU-540 | |
| 300 mL robotic reservoirs | Thermo or equivalent | 12-565-572 | |
| 96 baffled automation reservoirs | Thermo or equivalent | 1064-15-8 | |
| 500 mL sterile disposable storage bottles | Corning or equivalent | CLS430282 | |
| Microplate heat sealer | Thermo or equivalent | AB-1443A | |
| Microplate heat sealing foil | Thermo or equivalent | AB-0475 | |
| Cardamonin | Tocris or equivalent | 2509 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| SKF 86002 | Tocris or equivalent | 2008 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| DMSO | Sigma or equivalent | D8418 | |
| 48% hydrofluoric acid | Sigma or equivalent | 339261 | Corrosive and acute toxicity |
| 1000 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014382 | |
| 200 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014391 | |
| 20 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014392 | |
| 1000 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014497 | |
| 200 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013810 | |
| 20 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013808 | |
| Pipettor tips 1000 μL | Rainin or equivalent | 17002920 | |
| Pipettor tips 200 μL | Rainin or equivalent | 17014294 | |
| Pipettor tips 20 μL | Rainin or equivalent | 17002928 | |
| Chemical fume hood | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| 384-well sample storage plates | Thermo or equivalent | 262261 | |
| Sodium chloride | Sigma or equivalent | S6191 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo or equivalent | 14-959-49A | |
| Serological pipettes 50 mL | Corning or equivalent | 07-200-576 | |
| Serological pipettes 25 mL | Corning or equivalent | 07-200-575 | |
| Serological pipettes 10 mL | Corning or equivalent | 07-200-574 | |
| Serological pipettes 5 mL | Corning or equivalent | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells | N/A | N/A | These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore or equivalent | PHCC20060 | |
| GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument | Affymetrix or equivalent | 00-0372 | |
| Affymetrix 24- and 96-array plates | Affymetrix or equivalent | 901257; 901434 | |
| Draegger tube HF | Draeger or equivalent | 8103251 | |
| Draegger tube CP | Draeger or equivalent | 8103421 | |
| Draegger pump | Draeger or equivalent | 6400000 | |
| Clear Plate seals | Resesarch Products International or Equivalent | 202502 | |
| Reagent reservoirs | VistaLab Technologies or equivalent | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS or equivalent | N/A | Excel add-in used for automated curve fitting |
References
- Randleman, B., Hampton, R. . Drugs, Diseases and Procedures. , (2011).
- Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
- Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
- Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
- North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
- Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
- Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
- Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. . Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , (2012).
- Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
- Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
- Ruff, A. L., Dillman, J. F. Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
- Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
- . . Toxnet. , (2016).
- Bancroft, W. D. . The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, (1926).
- . . Chloropicrin Risk Characterization Document. , (2012).
- Aigueperse, J., et al. . Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
- Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
- . . Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , (2015).
- . . Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , (2017).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
- . . IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , (2016).
- Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
- . . GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , (2018).
- Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
- He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
- Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
- Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
- Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H., Seiber, J. N., et al. . Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. 652, (1997).
- Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
- Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
- Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
- Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
- Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
- van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
- Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
- Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
- Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
- . . ATCC Animal Cell Culture Guide. , (2014).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).
