GFP Lentivirus द्वारा उत्पंन Micrometastases के उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने-transduced एक मरीज से व्युत्पंन Organoids बृहदांत्र ट्यूमर
Summary
के लिए अत्यधिक संवेदनशील का पता लगाने की अनुमति मानव कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) कोशिकाओं बस्तियां ऊतकों, हम इस के साथ साथ एक प्रोटोकॉल दिखाने के कुशल transduction के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) lentiviral कणों में PDX-व्युत्पन्न सीआरसी organoid कोशिकाओं प्राप्तकर्ता चूहों में उनके इंजेक्शन से पहले, स्टीरियो-प्रतिदीप्ति सूक्ष्म अवलोकन के साथ.
Abstract
मानव कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) उपचार, कुछ कट्टरपंथी चिकित्सा में वर्तमान अग्रिम के बावजूद सीआरसी के देर चरणों के लिए प्रभावी रहे हैं । इस नैदानिक चुनौती, ट्यूमर xenograft माउस मॉडल लंबे समय से स्थापित मानव कार्सिनोमा सेल लाइनों और ट्यूमर के साथ कई ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग कर काबू पाने के लिए नैदानिक मॉडल के रूप में विकसित किया गया है । वे आंशिक रूप से मानव कार्सिनोमा की सुविधाओं की नकल है, लेकिन अक्सर आक्रमण और मेटास्टेसिस सहित मानव द्रोह के प्रमुख पहलुओं दोहराऊंगा असफल । इस प्रकार, वैकल्पिक मॉडल है कि बेहतर मानव सीआरसी में घातक प्रगति का प्रतिनिधित्व लंबे समय की प्रतीक्षा की गई है ।
हम इस के साथ साथ रोगी की पीढ़ी दिखाने के ट्यूमर xenografts (PDXs) द्वारा शल्य चिकित्सा एक मरीज से विच्छेदित छोटे सीआरसी टुकड़े के चमड़े के नीचे आरोपण । बृहदांत्र PDXs विकसित और histopathologically रोगी में सीआरसी सदृश । हालांकि, कुछ सहज micrometastases PDX मॉडल में प्रभावित सुदूर अंगों के पारंपरिक पार वर्गों में detectable हैं । दूर के अंगों में मेटास्टेटिक प्रसार का पता लगाने की सुविधा के लिए, हम संस्कृति में बृहदांत्र PDXs से ट्यूमर organoid कोशिकाओं को निकाले और उंहें GFP lentivirus के लिए उच्च immunodeficient मंजूरी में इंजेक्शन के लिए पहले से संक्रमित/शि-scid IL2Rγअशक्त (नोग) चूहे । Orthotopically इंजेक्शन PDX-व्युत्पन्न सीआरसी organoid कोशिकाओं लगातार प्राथमिक ट्यूमर प्राप्तकर्ता चूहों में GFP के लिए सकारात्मक रूप में । इसके अलावा, सहज micrometastatic GFP व्यक्त कालोनियों के विकास विशेष रूप से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा इन चूहों के फेफड़ों में पाया जाता है । इसके अलावा, सीआरसी organoids के intrasplenic इंजेक्शन अक्सर यकृत औपनिवेशीकरण पैदा करता है । एक साथ ले लिया, इन निष्कर्षों GFP-लेबल PDX-व्युत्पंन सीआरसी organoid कोशिकाओं नेत्रहीन एक multistep प्रक्रिया के दौरान पता लगाने के लिए आक्रमण मेटास्टेसिस झरना शब्द संकेत मिलता है । वर्णित प्रोटोकॉल मानव सीआरसी के PDXs की स्थापना और इसी सीआरसी organoid कोशिकाओं GFP lentiviral कणों द्वारा transduced के 3 डी संस्कृति शामिल हैं ।
Introduction
कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) कैंसर दुनिया भर में1की मौत का दूसरा प्रमुख कारण है । उंनत चरण रोग के साथ रोगियों के पारंपरिक उपचार के लिए अपर्याप्त प्रतिक्रिया मौलिक इलाज सीआरसी के प्रयास की कारगरता को इंगित करता है । अधिक प्रभावी चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने के लिए, कैंसर के विभिंन नैदानिक माउस मॉडल है कि सीआरसी की विशेषताओं की नकल की स्थापना की गई है । विभिन्न सीआरसी सेल लाइनों व्यापक रूप से उनकी सुविधा और हेरफेर में आसानी के कारण ट्यूमर xenografts उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । कैंसर सेल लाइनों की लंबी अवधि के संस्कृति, तथापि, अक्सर अद्वितीय कोशिका आबादी के चयन का कारण बनता है कि एक विशेष संस्कृति हालत के तहत काफी प्रफलन हैं, जिससे अविश्वसनीय परिणाम और नैदानिक दवा में महत्वपूर्ण सीमाओं में जिसके परिणामस्वरूप विकास.
इन विट्रो मेंकिया जा रहा बिना, रोगी-ट्यूमर xenografts (PDXs) भी मानव सीआरसी के ऊतकों के पशु मॉडल में आरोपण द्वारा उत्पंन किया गया है शल्य चिकित्सा2,3,4रोगियों से विच्छेदित । PDXs व्यापक रूप से recapitulating प्रमुख histopathological सुविधाओं और आनुवंशिक परिवर्तन मूलतः रोगियों जिसमें से वे प्राप्त किए गए के ट्यूमर में मौजूद के रूप में मांयता प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, रोगी-ट्यूमर कोशिका समूहों से बना organoids से व्युत्पंन 3 डी शर्तों के तहत संस्कृति द्वारा स्थापित किया गया है कि बारीकी से मूल ट्यूमर के जैविक गुण5,6नकल उतारा । ये ट्यूमर organoids भी उच्च प्रवाह दवा स्क्रीनिंग के लिए लागू किए गए, जिससे व्यक्तिगत चिकित्सा5डिजाइन किया जा करने की अनुमति । हालांकि, स्पष्ट रूप से विषम सीआरसी आबादी एक ट्यूमर के भीतर जन उपस्थित माना जाता है । विशेष रूप से सीआरसी आबादी चुनिंदा पैदा करना और vivo में और इन विट्रो में PDX और ट्यूमर organoids, क्रमशः के मार्ग की श्रृंखला के दौरान विस्तार हो सकता है । यह भी समग्र जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल और महामारी/प्रभावित सीआरसी की आनुवंशिक स्थिति को बदलने की अनुमति है, जिससे माता पिता के सीआरसी के लिए ंयूनतम समानता में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है ।
रोगी-सीआरसी organoids और oncogenic उत्परिवर्तनों के बंदरगाह संयोजन के लिए इंजीनियर गैर कैंसर मानव बृहदांत्र से निकाले गए भी ट्यूमर आक्रमण और मेटास्टेसिस द्वारा उदाहरण मानव ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है 6,7,8,9. तथापि, सहज मेटास्टेसिस रोगी के orthotopic आरोपण से उत्पंन होने वाली बहुत कम घटना-immunodeficient चूहों में सीआरसी व्युत्पंन, यह मुश्किल आक्रमण की multistep प्रक्रिया-मेटास्टेसिस झरना है कि स्थानीय शामिल अध्ययन करने के लिए बनाया गया है आक्रमण, intravasation, खून में परिवहन, extravasation और सुदूर अंगों की औपनिवेशीकरण4,10. Micrometastasis ≤ 2 मिमी के ट्यूमर सेल जमाव, रोगी द्वारा गठित सीआरसी organoids द्वारा प्रतिनिधित्व के रूप में, अक्सर प्रयोगात्मक माउस मॉडल में प्रभावित दूर अंगों से वर्गों के histopathological विश्लेषण पर अनदेखी की गई है । सहज micrometastases के दृश्य भी कुशलता से ट्यूमर organoid कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट मार्करों प्राप्तकर्ता चूहों में अपने इंजेक्शन से पहले शुरू करने की कठिनाई के कारण vivo में कम किया गया है । इस अध्ययन में, हम कुशलता से एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए PDX में transduce GFP lentivirus-3 डी संस्कृति में सीआरसी organoid कोशिकाओं प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्शन से पहले और अत्यधिक संवेदनशील का पता लगाने की अनुमति देने के लिए, स्टीरियो-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को रोजगार, उनके विभिन्न अंगों की औपनिवेशीकरण के लिए फार्म micrometastases.
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि सीआरसी PDX मॉडल व्यापक रूप से प्राथमिक ट्यूमर के विकास का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है, क्या इस मॉडल भी जांच ट्यूमर के लिए लागू है मेटास्टेसिस अभी तक पूरी तरह से आविर्भाव नहीं किया गया ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए Juntendo विश्वविद्यालय के युवा अन्वेषक पुरस्कार (२०१३, २०१४ और २०१५) के लिए Y.O., संयुक्त परियोजना पुरस्कार (२०१३ और २०१४) के लिए के. एम., और अनुदान में सहायता के लिए शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान मंत्रालय से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए समर्थन किया गया और प्रौद्योगिकी, जापान (16K15625 से वाई. के. और 16K15598 को M.G.). हम Coloproctological सर्जरी और उपयोगी चर्चा और तकनीकी सहायता के लिए आणविक विकृति विभाग के सभी सदस्यों के लिए विशेष रूप से आभारी हैं । हम भी डॉ हिरोयुकी Konno (हमामात्सू विश्वविद्यालय Schoolof मेडिसिन) और डॉ हिडेकी Kitajima (स्वास्थ्य और कल्याण के अंतरराष्ट्रीय विश्वविद्यालय) चूहों में orthotopic आरोपण के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में उदार तकनीकी मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद और डॉ. Yoshitaka हिप्पो (चिबा कैंसर सेंटर) ट्यूमर organoid संस्कृति प्रदर्शन पर तकनीकी सलाह के लिए ।
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
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