ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定
Summary
本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes による高解像度の呼吸の酸素消費量を測定する方法を説明します。この手法は古典的なミトコンドリアの分離法と比較して組織の最小限の量を必要として得られた結果、もっと生理学的に関連します。
Abstract
ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ代謝の研究のための新たなモデルを表します。確かに、ショウジョウバエは、構造の人間の臓器に相同性を持つし、非常に節約された代謝経路を持っている時間の短い期間で別の基礎的メカニズムの研究を可能にする比較的短い寿命を持っています。しかし、意外な細胞の代謝、ミトコンドリア呼吸に不可欠なメカニズムの 1 つは徹底的に触れられていないこのモデルです。ショウジョウバエにおけるミトコンドリア呼吸の測定は通常非常に多数の個人を必要とし、得られた結果が再現性が高いのでそうです。ここでは、ショウジョウバエから組織の最小限の量を使用してミトコンドリアの酸素消費量の正確な測定を許可する方法を説明します。この方法では、thoraxes を切除し、両方鋭い鉗子で機械的と化学的にサポニン、異なる化合物は細胞膜を通過し、ミトコンドリア呼吸を調節することができますグリセリンです。透過処理、したプロトコルが、ランプといくつかの阻害剤に彼らの対応だけでなく、異なる基質を酸化する電子輸送システム (ETS) の異なる複合体のキャパシティを評価する実行されます。このメソッドは、ミトコンドリアがまだ他の細胞成分との相互作用とミトコンドリアの形態が保存されているので、それはもっと生理学的に関連するとミトコンドリアの分離を用いた方法と比較して多くの利点を示します。また、サンプル準備の速度が速い、得られた結果が再現性が高い。ミトコンドリア呼吸性と代謝の研究のためのモデルとしてショウジョウバエの利点を組み合わせることにより新たな洞察が、発表することができます重要な特にときハエが発生している異なる環境や病態生理学的条件。
Introduction
ミバエショウジョウバエは、1世紀以上の遺伝子研究のモデル生物として使用されています。この生物の研究伴性継承2、突然変異率3、ニューラル システムの開発と細胞運命決定の4の重要な基礎知識にしかつながっていないが、また最近として浮上している、アルツハイマー病やパーキンソン病の5,6などいくつかの疾患に固有のメカニズムを研究する貴重なツールです。さらに、彼らは時間の短い期間で大量に発生する可能性が、寿命が短いと老化のプロセスを勉強する人気のあるモデルです。彼らはまた、インスリン産生細胞 (β 膵細胞に相当)、脂肪体 (同様には肝と白脂肪組織として機能している)、oenocytes (肝細胞様細胞)、心臓などの臓器に相同構造を所有しているだけでなく、体液代謝産物 (脊椎動物の血に似ています)7を輸送します。また、中間代謝 (インスリン/インスリン様成長因子のようなシグナル伝達経路およびラパマイシン ターゲット TOR 経路含む) の中央の道は、また非常に節約された7です。これらの理由から、ショウジョウバエは最近8糖尿病など代謝疾患固有の病態を中心に、代謝を制御する基本的なメカニズムを記述するため悪用されています。代謝の主要なコンポーネントは酸化的リン酸化プロセス (OXPHOS) を通じて ATP 生産、ミトコンドリア複数の経路を統合し、生命の最も重要な生物学的機能のいずれかを実行します。生物の代謝の中心的な役割を考慮したそれは、ミトコンドリアの機能障害がパーキンソン病9とアルツハイマー病10のような多くの病気だけでなく、筋萎縮性側索硬化症に関与していること意外ではないです。11,12. 老化プロセスの基本的な決定要因があります。確かに、酸化損傷11を通じて高濃度の細胞に有害なことができる細胞活性酸素種 (ROS) の主要な生産者しています。高齢化はまた破損または変異ミトコンドリア DNA13mitophagy 機能障害14,15ミトコンドリア生合成16障害の蓄積に関連付けられています。ミトコンドリアは細胞の恒常性の重要要因ではまた豊富や栄養素17,18の希少性によるといくつかの細胞機能を調節する別の基板を利用することができます。
確かに、ダイエット (炭水化物、脂質および蛋白質) のさまざまな栄養素に消化され、吸収され、細胞に運ばれます。細胞質に転化し、派生の基板は NADH や FADH219などの削減の同等物を製造しているミトコンドリアのマトリックスに運ばれます。これらの削減の同等は、電子輸送システム (ETS) の異なる酵素の複合体によって酸化されてし。これらの複合体は複合体など、ミトコンドリア内膜に埋め込まれている私と複合体 II。さらに、ミトコンドリアのグリセロール-3-リン酸脱水素酵素およびプロリン脱水素酵素など他の酵素の複合体は、ETS20,21に電子のエントリの代替ルートを表します。これらの ‘alternative’ 複合体は昆虫、特に重要として、種に応じて彼ら積極的に参加できる呼吸20,22,23,21を増加します。これらの ETS の供給システムからの電子は、最終的なアクセプター分子酸素まで、ユビキノン、その後複合体 III にし複雑な IV が転送されます。この電子の移動は、複雑な V (図 1) で ATP を ADP のリン酸化を運転内部のミトコンドリア膜プロトン動機力を生成します。病態生理学的ミトコンドリア細胞の恒常性は、キイロショウジョウバエ関連するモデルを表しますを用いたミトコンドリア代謝の勉強の中心的な役割の様々 なメカニズムを記述する強力なツールを検討条件または細胞と環境ストレスの下で。驚くほどしかし、研究の一握りだけは実際にショウジョウバエ24,25,26のミトコンドリアの呼吸を測定しました。確かに、ミトコンドリアの酸素消費量を評価することを目指して実験はミトコンドリアの分離を必要とします。分離が一般的にむしろ大量を必要とする (活性酸素産生やミトコンドリア効率27,28のマーカーとしての P/O 率) などさまざまなミトコンドリア機能の測定のために有利、いくつか個人24,29からのティッシュ。組織や個人の多量のためのこの要件は、重要な制限要因、特にすべての個人が同じ年齢であることを考えるとできれば実験のための同性の異なる時間に呼吸のメジャーを作る最高の状態で骨の折れるポイントします。さらに、ミトコンドリアの分離は、ミトコンドリア代謝を支配する根本的なメカニズムに重要な洞察力を提供できますが、ミトコンドリアの分離に使用するメソッドはレプリケート可能な結果を得ることの難しさなどいくつか欠点を持ってください。、ミトコンドリアのネットワークおよびミトコンドリアの構造と機能29,30,31の変質の中断。
本研究の目的は、非常に少数の個人から組織の最小限の量だけを用いたショウジョウバエのミトコンドリアの酸素消費量を測定するための堅牢なプロトコルを提示することです。このプロトコルでミトコンドリアの酸素消費量測定の in situショウジョウバエ thoraxes からグリセリン筋線維29を使用して高解像度呼吸32,33,との組み合わせで構成されています34,35ですこのメソッドも古典的なミトコンドリアの分離メソッドからセルの他のコンポーネントとの相互作用としても、ミトコンドリアの構造と機能はの保存よりグリセリンに比べて利点があります。繊維29,31,36, もっと生理学的に関連するこのアプローチになります。このプロトコルで、基板 ETS のいくつかの異なる段階で酸素消費量の決定をすること、ショウジョウバエの唯一の 3 つの thoraxes で使用する高解像度の呼吸ミトコンドリア機能することができます正確に評価されます。したがって、このプロトコルはショウジョウバエ モデルの利点を生かして多くの環境または病態生理学的条件のコンテキストで代謝を制御する基本的なメカニズムに関する質問に回答キーを助けることができます。
ETS のいくつかの異なる手順で酸素消費量を測定し、どのように異なる基板を評価する呼吸、別基板 (図 1)、ランプに貢献し、阻害剤が使用される30の透過後、組織。具体的には、異なる基板上の順次追加、ETS の異なる複合体を介して電子のエントリを刺激するために実行されます。シアン化物のカルボニル、ランプ 4-(フッ素系低分子) phenylhydrazone (FCCP) は非結合呼吸を測定するための最適な濃度で追加した、すなわち、非リン酸化呼吸筋酸素消費量刺激されます。複合体 I、II、および III は ETS 非酸化反応により、残留酸素の消費量を監視する実行し、順次抑制。N, N, N の注入による複雑な IV 最大呼吸能力を評価できる最後に、’、N – テトラメチル – p-フェニレンジアミン (受けた東京都警視庁)、人工電子プロバイダーとアスコルビン酸。それはハエの発生する温度なので、24 °C で実験が行われているに注意してくださいすることが重要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、ショウジョウバエにおけるミトコンドリアの酸素消費量の測定前の試料の調製方法を説明します。このメソッドは、期間、必要な人数の面で特に、ミトコンドリアの分離を使用してプロトコルに関連するさまざまな問題を克服するために開発されました。通常いくつかの個人から得られた組織の大規模な量を必要とするミトコンドリアの分離ではなく、この実験はいくつかのシ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学工学研究協議会 (レベル、探索許可) およびユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトンから NP に補助金によって賄われていた。1塩基変異は、健康研究 (機構)、ニュー ・ ブランズウィック州イノベーション財団 (NBIF) およびユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトンのカナダの研究所から資金調達のサポートを確認したいと思います。EHC の作業をサポートするには、カナダ、脳カナダ、レベル、カナダ乳がん基金、ニュー ・ ブランズウィック州技術革新基金、ニューブランズウィックの健康研究財団のアルツハイマー協会とユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトン。
Materials
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
References
- Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
- Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
- Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. 유전학. 26 (1), 23-51 (1941).
- Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
- Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
- Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson’s disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
- Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
- Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
- Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. 유전학. 201 (2), 377-402 (2015).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120 (4), 483-495 (2005).
- Szibor, M., Holtz, J. Mitochondrial ageing. Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
- Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
- Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. Nutrient-sensing mechanisms and pathways. Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
- McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
- Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).
- Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
- Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).
- Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
- Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
- Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology – Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
- Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
- Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
- Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry?. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).
