השרשה בצינורית לתוך המלון Cisterna של מכרסמים
Summary
כאן נתאר פרוטוקול לבצע cisterna מגנה תעלות (CMc), דרך פולשנית כדי לספק קליעים נותבים, מצעים, מולקולות איתות לתוך נוזל מוחי שדרתי (CSF). CMc בשילוב עם שיטות הדמיה שונות, מאפשרת המערכת glymphatic CSF dynamics הערכה, וכן משלוח המוח ברוחב של תרכובות שונות.
Abstract
Cisterna מגנה תעלות (CMc) היא תהליך פשוט המאפשר גישה ישירה נוזל מוחי שדרתי (CSF) ללא נזק פעיל הגולגולת או parenchyma המוח. בחולדות מרדימים, החשיפה של קרום הדורה ע י ניתוח עמום של שרירי הצוואר מאפשר החדרת הצינורית לתוך המלון cisterna (ס מ). הצינורית, חיבר או על ידי מחט משופע בסדר או בורוסיליקט נימי, מחוברת דרך צינור פוליאתילן (PE) מזרק. באמצעות מזרק משאבה, מולקולות יכול אז להיות מוזרק במחירים מבוקרים ישירות לתוך ס מ, אשר היא רציפה עם תת-עכבישי החלל. מן החלל תת-עכבישי, אפשר לאתר CSF פלקסים על ידי זרימת הולכת חום לחלל perivascular סביב רבים חודר, שבו מתרחשת ממס exchange עם נוזל interstitial (ISF). CMc ניתן לבצע זריקות חריפה מיד לאחר הניתוח, או השרשה כרונית, עם הזרקת מאוחר יותר מרדימים או ער, לנוע בחופשיות מכרסמים. כימות של התפלגות מעקב ב- parenchyma המוח יכול להתבצע על ידי epifluorescence, 2-פוטון מיקרוסקופ, דימות תהודה מגנטית (MRI), בהתאם המאפיינים הכימי פיזיקלי של מולקולות מוזרק. לפיכך, CMc בשילוב עם טכניקות הדמיה שונות מציע כלי רב עוצמה עבור הערכה של מערכת glymphatic ו CSF dynamics ובפונקציה. יתר על כן, CMc יכול להיות מנוצל כמו צינור של משלוח מהיר, המוח-רחב של איתות מולקולות ותערובות מטבולית זאת יכולה אחרת לעבור את מחסום הדם מוח (BBB).
Introduction
נוזל מוחי שדרתי (CSF) מתרחץ מערכת העצבים המרכזית (CNS) ברחבי המערכת חדרית ולאורך את החללים תת-עכבישי, לחלל מוגדר מבחינה אנטומית של רצף עם החדרים, המקיף את המוח ואת חוט השדרה. אחד התפקידים העיקריים של CSF נועד לספק נתיב לאישור של מטבוליטים, מומסים בגבול מ parenchyma המוח. סיווג נעשית באמצעות glymphatic שנתגלתה לאחרונה מערכת1, המוח אנלוגית למערכת הלימפה ההיקפית. במסמך זה, אנו מתארים ולדון cisterna מגנה תעלות (CMc), שיטה פולשנית למסירה ישירה של מולקולות אל תוך שדרתי. CMc היא שיטת המפתח ללמוד את הפונקציה glymphatic. יתר על כן, ניתן גם להחיל CMc עבור חקר הדינמיקה CSF, משלוח מהיר, המוח ברוחב של הלא-דם מוח מחסום (BBB) מולקולות חדיר אל parenchyma המוח, לאורך החלל perivascular.
CMc מנצלת עקרונות פיזיולוגיים של CSF הדינמיקה התנועה דרך מערכת העצבים כדי לספק מעקב שכותרתו מולקולות או סמים לתוך מרחב מלא נוזל מוחי-שדרתי של המלון cisterna (ס מ). מולקולות מוזרקים דרך בצינורית מושתל לתוך כיסוי קרום קרום atlanto-העורף שהמולקולות ס”מ. ואז מתבצעות על ידי נוזל מוחי-שדרתי בצובר מזרימה parenchyma המוח דרך החלל paravascular1. הסוכן נותב או הניגוד מוזרק דרך CMc עוקב אחר תנועת נוזל מוחי-שדרתי, אשר מאפשר את ההערכה של CSF תנועה, זרם glymphatic על ידי לכימות רמות העוצמה של מולקולות שכותרתו מזין parenchyma המוח. CMc הוא תואם עם טכניקות הדמיה שונות, כולל epifluorescence, 2-פוטון מיקרוסקופיה של דימות תהודה מגנטית (MRI). בנוסף, ההערכה ניתן לבצע שני ויוו או ex-vivo. חשוב לציין, CMc מאפשר הפריט החזותי של מערכת glymphatic בהרדמה או במהלך השינה הטבעית, כמו גם בבעלי חיים ערה, נעה בחופשיות.
הטכניקה CMc יכול להיות מנוצל כדי לחקור היבטים שונים של דינמיקה של נוזלים ב- CSF, אבל הוכיחה להיות שימושי במיוחד ללמוד את המערכת glymphatic. Glymphatic פעילות כוננים הזרימה הולכת חום של CSF מן המרחב periarterial דרך תעלות מים aquaporin-4 (AQP-4), אשר הם בסככות הקרום של endfeet וסקולרית גלישת astrocytic. הזרם הולכת חום מאפשרת למחלף של CSF, נוזל בין-תאי (הקרן) בתוך parenchyma המוח. CSF/הקרן המכיל פסולת מטבולית, מומסים בגבול ואז הוסר parenchyma המוח דרך2,שטח perivenous3. בסופו של דבר, CSF/הקרן מגיע הפריפריה דרך כלי הלימפה קרום תיאר לאחרונה4,5. מערכת glymphatic הוכח חיונית עבור פינוי של מטבוליטים פסולת מזיקים כגון עמילואיד-β2. בהמשך, glymphatic סיווג נמצא לקוי הזדקנות6, לאחר פגיעה מוחית טראומטית7, ו במודלים חייתיים של סוכרת8 ו מחלת אלצהיימר9. ראוי לציין, glymphatic פעילות היא מדינה התלויים, מציג פעילות גבוה משמעותית במהלך שינה או הרדמה בהשוואה ערות1. אכן, אפרוחי ומורדמת להפגין את הפעילות glymphatic הגבוהה ביותר. לפיכך, כימות ניסיוני של פעילות glymphatic חיוני כשלמדתי תפקידה מחלה ובריאות.
מספר מחקרים עסקו CSF dynamics ולהחלפה שלה עם נוזל בין-תאי (הקרן) ב- parenchyma המוח. עם זאת, השיטות באמצעותו מועברות שכותרתו מולקולות הן פולשני למדי, מפעילה נזק מוחי parenchyma ושינויים בלחץ תוך גולגולתי (ICP) (ראה סקירת10). כמה דוגמאות הן ע או זריקות intraparenchymal אשר כרוכות גולגולת או קידוח של צמח קוצני חור בגולגולת. הליכים אלה הוכחו לשנות ICP, ובכך לשבש את פעולת הפונקציה glymphatic2. כמו כן, שיטות פולשניות כאלה זירוז astrogliosis ולהגדיל את immunoreactivity AQP-4 בשטח parenchyma פגום המוח,11,שלה הסביבה12. כמו האסטרוציטים ו- AQP-4 הם רכיבי מפתח של מערכת glymphatic, CMc היא השיטה של בחירה ללימודים שלה. היתרונות הגדולים של CMc בהשוואה הליכים פולשניים יותר הם קיום שלם הגולגולת והמוח parenchyma, הימנעות ICP שינויים astrogliosis, בהתאמה. לפיכך, CMc בשילוב עם כלי הדמיה שונים פותח עבור מגוון רחב של אפשרויות ללמוד לא רק את מערכת glymphatic, אלא גם את הדינמיקה ואת מנגנוני זרימה הומאוסטזיס, כמו גם מודלים חייתיים של מחלות נוירולוגיות.
ההליך תעלות (CMc) מגנה cisterna מאפשר גישה קלה וישירה נוזל מוחי שדרתי (CSF). על ידי הזרקת מולקולות שונות (למשל פלורסנט המשדרים, סוכנים בניגוד MRI) הנסיין ניתן לעקוב אחר תנועתם בתוך תא CSF, להעריך את הפעילות של מערכת glymphatic. הפרוטוקול הבא מתאר שני CMc חריפה של, לזריקות מיד לאחר ניתוח ולאחר כרונית השרשת הצינורית, שבו החיה והשיחזור הליך כירורגי זריקה מאוחר יותר. ההבדל החשוב ביותר בין השתלה אקוטי וכרוני הוא ההשתלה כרונית מאפשרת לצורך המחקר של פעילות glymphatic בעכברים ער.
Protocol
Representative Results
Discussion
הציגו לנו פרוטוקול המתאר הליך מפורט של תעלות מגנה cisterna (CMc), אשר מציעה שיטה פשוטה כדי לספק מולקולות שכותרתו תא CSF. CMc מאפשר את החזיית העוקבים CSF דינמיקה, גם אין ויוו וגם ex-vivo, באמצעות שיטות הדמיה שונות או היסטולוגיה.
אחד היתרונות העיקריים של הטכניקה CMc טמון שלה גישה ישי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן נובו נורדיסק, המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות ושבץ, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. ו- S.H-R הם מקבלי מלגת פוסט-דוקטורט, מלגת דוקטורט מטעם קרן לונדבק, בהתאמה.
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -. A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE–the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
