Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade
Summary
Recombinase bağımlı rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) kesici enjeksiyon herhangi bir genetik olarak etiketli hücre tipi spinal kord işlemek için kullanılabilir. Burada biz lomber spinal kord dorsal boynuz nöronlarda transduce anlatan. Bu teknik işlenmiş nöron alt türündeki fonksiyonel sorgulama sağlar.
Abstract
Omurilik nöronal altgrupları seçici manipülasyon esas olarak iki farklı yöntemlerle elde: 1) Intersectional genetik, mademki ikili ya da üçlü transgenik fareler bir muhabir veya efektör seçici ifade ulaşmak için oluşturulur Gen (örneğin, Rosa26 odağı üzerinden) istenen spinal nüfus. 2) Cre-bağımlı rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV); kesici enjeksiyon Burada seçim muhabir veya efektör gen için kodlama Cre-bağımlı AAV vektörel çizimler Cre recombinase istenen nöronal subpopulation içinde ifade farelerin omurilik içine enjekte edilir. Bu iletişim kuralı Cre-bağımlı rAAV vektörel çizimler oluşturmak açıklar ve nasıl lomber spinal kord dorsal boynuz nöronlarda transduce L3-L5 kesimleri ile rAAVs. L3-L5 innervated hindlimbs duyusal bilgileri iletmek bu çevresel duyusal sinir hücreleri tarafından lomber spinal segmentler kendiliğinden davranış ve enjeksiyon tarafına Ipsilateral hindlimb uygulanan duyusal testler için yanıt olabilir duyusal işleme işlenmiş nöronlarda işlevi sorguya çekmek için analiz. Biz kümelerinden oluşan omurilik sinir hücreleri genetik olarak analiz etmek için bu tekniği nasıl kullanılacağını gösteren örnekler sağlar. Virüs-aracılı transgene ifade Cre transgenik farelerde klasik muhabir fare kaynaklı transgene ifadesine göre başlıca avantajları şunlardır: 1) çeşitli muhabir veya efektör proteinlerin kodlama farklı Cre-bağımlı rAAVs olabilir Böylece birkaç birden fazla transgenik fare satırları oluşturma gereğini üstesinden tek Cre transgenik satır enjekte. 2) kesici enjeksiyon enjeksiyon yeri ve enjeksiyon sonra zaman Cre ifade hücreleri manipülasyon sınırlar. Ana dezavantajları vardır: 1) muhabir gen ifade rAAVs iş daha fazla değişken. 2) cerrahi spinal sinir hücreleri ilgi transduce için gereklidir. İki yöntem daha uygun olduğu ele alınması nöron nüfus ve araştırma soru üzerinde bağlıdır.
Introduction
Dorsal spinal kord çevre vücut ve beyin arasında bilgi değişimi için gerekli olduğunu. Isı, soğuk, gibi duyusal uyaranlara dokunmak veya zararlı uyaranlara hangi nöronlar bu bilgileri omurilik dorsal boynuz, özel çevre nöronlar tarafından tespit edilir. Burada, eksitatör ve inhibitör interneurons karmaşık bir ağ gelen ve sonunda röle duyusal bilgi yolu ile spinal projeksiyon nöronlar supraspinal için1,2siteleri. Omurilik tarafından yapılan hesaplamaları Inter- ve projeksiyon nöronlar kapı duyusal bilgi, böylece hangi bilgilerin bastırılır veya hangi yoğunlukta geçirilen belirleme. Değişiklikleri inhibisyonu ve uyarma, arasında değişen bir denge gibi duyusal uyaranlara entegrasyonundaki aşırı duyarlılık ya da allodynia (normalde non-feci stimülasyon sonra acı hissi) gibi duyusal işlev bozuklukları neden olabilir. Bu değişiklikleri çeşitli kronik ağrı altta yatan neden3,4devletler olduğu düşünülür. Böylece, duyusal işleme yüksek öneme sahip spinal devreleri vardır ve bu nedenle bir canlı çevre ve benlik algısı. Son varış ve moleküler, genetik bir kombinasyonu ve genetik olarak tanımlanan omurga nöron altgrupları kesin manipülasyon sağlar cerrahi teknikleri ile bilim adamları şimdi temel spinal devreleri anlamaya başlıyor farklı duyusal yöntemleri işlenmesi için sorumludur.
RAAV kesici enjeksiyon vahşi-türü veya transgenik fareler içine büyük katkıda bulundu işleme, analiz ve omurilik sinir hücreleri5,6,7, belirli alt kümeleri işlev anlayışı 8 , 9 , 10 , 11. bu teknik teslimat işaretçisi proteinlerin sağlar (GFP gibi / GFP füzyon protein), muhabir proteinler (örneğin, GCaMP) veya (örneğin, bakteriyel toksinler, channelrhodopsin veya pharmacogenetic reseptörleri) efektör proteinler arasında bir dağınık şekilde spinal sinir hücreleri sınırlı şekilde. Cre-bağımlı rAAVs yerel enjeksiyon transgenik fareler Cre recombinase spinal sinir hücreleri belirli alt kümesinde ifade içine ilgili nöronal nüfus belirli analiz sağlar. Biz etiket, ablate, inhibe veya bu gösteren nöronlar onlar ağrı kontrol spinal kapı önemli bir parçası ve iletim7kaşıntı spinal glycinergic etkinleştirmek için bu tekniği istihdam. Bu deneylerde Cre-bağımlı rAAV kesici enjeksiyon GlyT2::Cre fareler içine glycinergic nöronlar lomber spinal kord seçici manipülasyon etkin. Böylece, eş zamanlı glycinergic nöronlar hayvan yaşam için kritik içeren supraspinal devreleri manipülasyon önlenebilir.
RAAVs kesici bir enjeksiyon enjeksiyon sitesine enfeksiyon sınırlar, viral iletim sadece yerel nöronlar zamanda aksonal projeksiyonlar enjeksiyon siteye bağlanmak nöronlar gelişebilir. İkinci kez belirli bir çekirdek beyinde nöronal giriş sağlayan izleme CNS alanları için kullanılır. Zaman nöronlar tanımlanmış nüfusu belirli bir sitede eğitimi aksonal projeksiyonlar enfeksiyon ancak, aynı zamanda bir karıştırıcı faktör olabilir. Bu sorunları çözmek için biz son zamanlarda AAV serotipleri ve serotipleri ve en aza indirmek ya da retrograd iletim en üst düzeye çıkarmak için kullanılan rehberleri tanımlamak için ifade kaset kapsamlı bir analiz yaptık. Omurilik devrelerde bu özel araştırma bağlamında analiz ettik retrogradely dorsal kök gangliyon (DRG), ventromedial rostral medulla (RVM) ve somatosensor korteks nöronlar transduce yeteneği farklı serotipleri ve rehberleri 12. bu protokol için özetlenen teknik bu nedenle enjeksiyon yerinde omurilik sinir hücreleri çözümlemek veya spinal kord enjekte sitenin giriş sağlamak projeksiyon nöronlar analiz etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan protokolünde rAAV üç iğne sol tarafındaki lomber spinal kord içine üç lomber segmentlere (L3-L5) nöron iletimi sağlamak için gerçekleştirilir. L3-L5 kesimleri duyusal girdi çoğunluğu enjeksiyon siteye hindlimb Ipsilateral alırsınız. Böylece genetik olarak etiketli nöron alt türündeki devre işlevi için fonksiyonel kanıt sağlayan fonksiyonel genetik olarak etiketli L3-L5 nöronlarda manipülasyon sağlam davranış değişiklikleri, uyandırmak için yeterli olduğunu ispat.
Protocol
Representative Results
Discussion
AAVs kesici enjeksiyon yüksek zamansal ve mekansal çözüm ile spinal hücreleri analizini sağlayan güçlü bir teknik araştırma laboratuvarında hale gelebilir. Bu iletişim kuralı hindlimb için onların periferik aksonlar uzanan duyusal sinir hücreleri tarafından innervated üç ana omurga segmentleri iletim sağlar. Üç transducing sağlam ve tekrarlanabilir davranış veri üretir. Ayrıca mümkün daha geniş bir duyu alanı tek bir kesici enjeksiyon sonra test sağlar. Örneğin, aynı enjeksiyon rejimi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hanns Ulrich Zeilhofer cömertçe Bu eser destek için teşekkür ederiz. Hendrik Wildner Olga Mayenfisch Vakfı tarafından desteklenmiştir. Carmen Birchmeier Lmx1b antikor için teşekkür ederiz.
Materials
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) | Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
References
- Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
- Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
- Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
- Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
- Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
- Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
- Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
- Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
- Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
- Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
- Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
- Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
- Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
- Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).
