اختبار دور البلازميدات Multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية
Summary
نقدم هنا طريقة تجريبية لاختبار دور البلازميدات multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية.
Abstract
والبلازميدات multicopy وفيرة جداً في بدائيات النوى ولكن دورها في تطور البكتيريا ما زالت غير مفهومة. ونحن مؤخرا أظهرت أن الزيادة في عدد نسخ الجينات كل خلية يقدمها والبلازميدات multicopy يمكن أن تسرع تطور الجينات المرمزة بلازميد. في هذا العمل، نحن نقدم نظام تجريبي لاختبار قدرة والبلازميدات multicopy لتعزيز التطور الجيني. باستخدام أساليب بسيطة في مجال البيولوجيا الجزيئية، نحن تشييد نظام نموذج حيث يمكن إدراجها جينات مقاومة للمضادات الحيوية في MG1655 الإشريكيّة القولونية ، في الكروموسوم أو في بلازميد multicopy. نحن نستخدم نهج تجريبي تطور لتنتشر سلالات مختلفة تحت التركيزات المتزايدة للمضادات الحيوية ونقيس بقاء السكان البكتيرية على مر الزمن. يتم اختيار الجزيء المضادات الحيوية والجينات المقاومة حيث أن الجينات يمكن أن يمنح فقط المقاومة من خلال الحصول على الطفرات. ويوفر هذا النهج “الإنقاذ تطورية” طريقة بسيطة لاختبار إمكانات والبلازميدات multicopy لتعزيز اكتساب المقاومة للمضادات الحيوية. في الخطوة التالية للنظام التجريبي، تتسم الأسس الجزيئية للمقاومة للمضادات الحيوية. تحديد الطفرات مسؤولة عن الحصول على مقاومة المضادات الحيوية نستخدم العميق تسلسل الحمض النووي للعينات التي تم الحصول عليها من شعوب بأكملها والحيوانات المستنسخة. أخيرا، لتأكيد دور الطفرات في الجينات قيد الدراسة، إعادة بناء عليها في الخلفية الأبوية واختبار النمط الظاهري مقاومة للضغوط الناجمة عن ذلك.
Introduction
المقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا هي مشكلة صحية رئيسية1. على مستوى أساسي، انتشار المقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا المسببة للأمراض مثال بسيط للتطور بالانتقاء الطبيعي2،3. ببساطة، استخدام المضادات الحيوية يولد التحديد لسلالات مقاومة. ولذلك، هو مشكلة رئيسية في علم الأحياء التطوري، لفهم العوامل التي تؤثر على قدرة سكان الجرثومي تتطور المقاومة للمضادات الحيوية. انتقاء التجارب قد برزت بوصفها أداة قوية جداً للتحقيق في علم الأحياء التطوري من البكتيريا، وقد أنتج هذا الحقل رؤى لا يصدق في طائفة واسعة من المشاكل التطورية4،،من56. في تطور تجريبية، باساجيد البكتيرية السكان بدأ من سلالة واحدة أبوية هي متسلسل تحت ظروف محددة وأحكام الرقابة. بعض الطفرات التي تحدث خلال نمو هذه الثقافات زيادة اللياقة البدنية البكتيرية، وهذه تنتشر عبر الثقافات بالانتقاء الطبيعي. أثناء التجربة، تصان دورياً جثمان عينات السكان لإنشاء سجل الأحفوري مجمدة غير المتطورة. يمكن استخدام عدد كبير من النهج لتميز تطور السكان البكتيرية، ولكن هاتين الطريقتين الأكثر شيوعاً هي فحوصات اللياقة البدنية، التي تقيس قدرة البكتيريا تطورت للتنافس ضد أسلاف بعيدة، وتسلسل الجينوم الكامل، الذي يستخدم لتحديد التغييرات الوراثية أن التكيف مع محرك الأقراص. في أعقاب العمل الرائد ريتشارد لينسكي والزملاء7،8، كان النهج الموحدة في تطور تجريبية للطعن في عدد قليل نسبيا من السكان نسخ متماثل (عادة < 10) مع تكييف جديد التحدي البيئي، مثل مصادر الكربون الجديدة، ودرجة الحرارة، أو بالعاثية المفترسة.
الالتهابات التي تسببها البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية يصبح مشكلة كبيرة عندما تكون المقاومة عالية بما يكفي أن من غير الممكن لزيادة تركيزات المضادات الحيوية إلى مستويات قاتلة في أنسجة المريض. الأطباء لذلك مهتمون بما يسمح للبكتيريا تتطور المقاومة لجرعات عالية من المضادات الحيوية التي فوق هذا تركيز المضادات الحيوية العتبة، توقف السريرية. كيفية دراسة هذا تجريبيا؟ إذا كان عدد صغير من السكان البكتيرية وتحدي مع جرعة عالية من المضادات الحيوية، كما هو الحال في نمط لينسكي التجربة، ثم النتيجة الأكثر ترجيحاً أن المضادات الحيوية سوف تدفع جميع السكان لخطر الانقراض. في الوقت نفسه، إذا كانت الجرعة من المضادات الحيوية المستخدمة منخفضة، دون تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) السلالة الأبوية، ثم أنها من غير المرجح أن سكان الجرثومي ستتطور المستويات ذات الصلة سريرياً للمقاومة، خاصة إذا كان وتقوم المقاومة بتكلفة كبيرة. واحد وسط بين هذين السيناريوهين استخدام “إنقاذ تطورية” تجربة9،10،11. وفي هذا النهج، عدد كبير جداً من الثقافات (عادة > 40) هو تحدي مع جرعة من المضادات الحيوية التي تزيد مع مرور الوقت، عادة بمضاعفة تركيز المضادات الحيوية كل يوم12. السمة المميزة لهذه التجربة هو أن أي مجموعة من السكان التي لا تتطور المقاومة المتزايدة سوف تكون مدفوعة إلى الانقراض. معظم السكان وتحدي بهذه الطريقة سوف تكون مدفوعة منقرضة، ولكن سوف تستمر أقلية صغيرة من تطور مستويات عالية من المقاومة. في هذه الورقة، ونظهر كيف يمكن استخدام هذا التصميم التجريبي للتحقيق بلازميد multicopy مساهمة التطور المقاومة.
اكتساب البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية من خلال اثنين من الطرق الرئيسية، والطفرات الصبغية، والحصول على عناصر وراثية متحركة، معظمها والبلازميدات13. والبلازميدات دوراً رئيسيا في تطور المقاومة للمضادات الحيوية لأنها قادرة على نقل الجينات المقاومة بين البكتيريا بتصريف14،15. والبلازميدات يمكن تقسيمها إلى مجموعتين وفقا لحجمها وعلم الأحياء: “الصغيرة”، مع عدد نسخ عالية في الخلايا البكتيرية و ” الكبيرة ”، مع انخفاض نسخ رقم16،17. وتم توثيق دور البلازميدات كبيرة في تطور المقاومة للمضادات الحيوية على نطاق واسع لأنها تشمل والبلازميدات كونجوجاتيفي، وهي العوامل الرئيسية الدافعة لنشر المقاومة والمقاومة متعددة بين البكتيريا15. والبلازميدات multicopy الصغيرة أيضا شائعة جداً في البكتيريا،من1718، وأنهم كثيرا ما رمز ل جينات مقاومة المضادات الحيوية19. ومع ذلك، درست دور البلازميدات multicopy الصغيرة في تطور المقاومة للمضادات الحيوية بدرجة أقل.
في عمل مؤخرا، اقترحنا أن والبلازميدات multicopy يمكن أن تسرع تطور الجينات يقومون بزيادة معدلات تحور الجينات بسبب ارتفاع عدد نسخ المورثات كل خلية12. باستخدام نموذج تجريبي مع سلالة كولاي MG1655 وجين β-lactamase بلوختيم-1 فإنه يظهر أن والبلازميدات multicopy تسارع معدل ظهور الطفرات تيم-1 تمنح المقاومة للجيل الثالث سيفالوسبورين ceftazidime. وأشارت هذه النتائج إلى أن البلازميدات multicopy قد تلعب دوراً مهما في تطور المقاومة للمضادات الحيوية.
هنا، فإننا نقدم وصفاً مفصلاً للأسلوب الذي قمنا بتطوير التحقيق في تطور بلازميد بوساطة multicopy مقاومة المضادات الحيوية. هذا الأسلوب له ثلاث خطوات مختلفة: الأولى، الإدراج من الجينات قيد الدراسة في بلازميد multicopy أو كروموسوم البكتيريا المضيفة. ثانيا، استخدام التطور التجريبي (التطوري الإنقاذ) لتقييم إمكانيات سلالات مختلفة للتكيف مع الضغط الانتقائي. والثالثة، وتحديد أسس الجزيئية الكامنة وراء تطور بلازميد بوساطة استخدام الحمض النووي تسلسلها وتعمير الطفرات المشتبه فيهم على حدة في النمط الوراثي الأبوية.
وأخيراً، على الرغم من أن تم تصميم البروتوكول هو موضح هنا للتحقيق في تطور المقاومة للمضادات الحيوية، يمكن القول أن هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة بصورة عامة لتحليل تطور الابتكارات التي اكتسبها الطفرات في أي multicopy ترميز بلازميد الجينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم بروتوكول جديد يجمع بين البيولوجيا الجزيئية وتطور تجريبية وعميق تسلسل الحمض النووي تهدف إلى التحقيق في دور البلازميدات multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا. على الرغم من أن هذا البروتوكول هو يجمع بين التقنيات من مختلف المجالات، جميع الوسائل اللازمة لتطوير ذلك بسيطة، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل وأيده دي معهد الصحة كارلوس الثالث (دي “خطة الحكومي” أنا + د + أنا 2013-2016): منح CP15 00012، PI16-00860، وسيبير (CB06/02/0053)، شاركت في تمويله “الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية” ” طريقة لتحقيق أوروبا ” (سيطلب). جاي معتمد من قبل البرنامج Atracción de talento حكومة منطقة مدريد (2016-T1/بيو-1105) وأنا + “اكسسيلينسيا د” للاسباني دي وزارة الاقتصاد، اندستريا y كومبيتيتيفيداد (BIO2017-85056-P). ASM معتمد من قبل على “ميغيل سيرفيت زمالة” من معهد دي السعود كارلوس الثالث (MS15/00012) شاركت في تمويله الصندوق الاجتماعي الأوروبي “الاستثمار في المستقبل” (كلية العلوم التربوية) وسيطلب.
Materials
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
References
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
- Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
- Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
- Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
- Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
- Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
- San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
- Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
- Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
- Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
- San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
- Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d’Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
- Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
- . . Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , (2009).
- Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
- Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
- Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
- Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).
